1．学习分光光度计的原理和使用方法。 2．学习测定淀粉酶活力的方法。
3．了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。
二、实验原理
种子中贮藏的碳水化合物主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖的一类水解酶。几乎所有植物中都存在淀粉酶，尤其是萌发的禾谷类种子，淀粉酶活性最强。主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶（还有异淀粉酶和糖化淀粉酶等）。休眠种子中主要含有β-淀粉酶，而α-淀粉酶是在萌发过程中形成的。种子萌发时，淀粉酶活性随萌发时间迅速增加，将淀粉分解成小分子糖类，供幼苗生长。α-淀粉酶随机水解淀粉的α-1,4-糖苷键，作为淀粉分解的起始酶而起主要作用；其水解产物为麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖；β-淀粉酶水解非还原端的第二个α-1,4-糖苷键，水解产物为麦芽糖，并能使一部分糊精糖化。 两种淀粉酶具有不同理化特性，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化；β-淀酶不耐热，在70℃下15min则被钝化。据此，在测定时钝化其中之一，就可以测定出另一种酶的活力，我们可以采用加热钝化β-淀粉酶测出α-淀粉酶活力，再与非钝化条件下测得的总淀粉酶活力比较，求出β-淀粉酶活力。淀粉的水解产物麦芽糖有还原性能与3,5-二硝基水杨酸试剂反应，使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖（或葡萄糖）浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。
三、器材和试剂
（一）器材
1．25毫升刻度试管。2．吸管。3．乳体。4．离心管。 5．分光光度计。6．离心机。7．恒温水浴。 （二）试剂
1. 0.1％标准麦芽糖溶液 20毫升：精确称量100毫克麦芽糖，用少量水溶解后，移入100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度。
2．pH 6.9，0.02摩尔／L磷酸缓冲液 100毫升
3．l％淀粉溶液100毫升：1克可溶性淀粉溶于100毫升 0.02摩尔／L磷酸缓冲液，其中含有 0.006摩尔／L氯化钠。
4．l％3,5-二硝基水杨酸试剂: 1g 3,5-二硝基水杨酸溶于20毫升2摩尔／L的氢氧化钠溶液和50毫升水中；再加人30克酒石酸钾钠，定客至100毫升。若溶液混浊，可过滤。 5．l％氯化钠溶液300毫升 6．海砂5克
四、操作步骤
1．种子发芽：
小麦种子浸泡2.5小时后，放人25℃恒温箱内或在室温下发芽。
2． 酶液提取：
取发芽第三天或第四天的幼苗15株，放人乳钵内，加海砂 200毫克，加 1％氯化钠溶液10毫升，用力磨碎。在室温下放置 20分钟，搅拌几次。将提取液离心（l500转／min）6－7分钟。将上清液倒人量筒，测定酶提取液的总体积。进行酶活力测定时，将酶提取液稀释10倍。
32
取干燥种子15粒作为对照（提取步骤同上）。 3．酶活力测定：
（1）取25毫升刻度试管4支。编号。按下表要求加人各试剂（各试剂须25℃预热10分钟）。 酶液 标准麦芽糖溶液 淀粉溶液 蒸馏水 液2毫升。
（2）取出各试管，放人沸水浴中加热5分钟。冷至室温，加水稀释至25毫升。将各管充分混匀。
（3）用空白管作对照；在500毫微米处测定各管的光吸收值，将读数填人上表。 4．计算
根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即：A标准／A未知＝C标准／C未知 则C（酶液管浓度）＝A酶×C标准／A标准 总活力单位= C酶×N酶×V酶 N为酶液的稀释倍数 V为测量后酶液的总体
1（干种子） 0.5 ---- 1 ---- 2（湿种子） 0.5 ---- 1 ---- 3（标注管） ---- 0.5 1 ---- 4（空白管） ---- ---- 1 0.5 将各管混匀，放在25℃，水浴中保温3分钟后，立即向各管中加人1％3,5-二硝基水杨酸溶
实验九 血糖的定量测定（GOD-PAP法）
一、实验目的：
学习GOD-PAP法测定血糖含量的原理和方法。
二、实验原理：
动物血液中的糖主要是葡萄糖，正常情况下，其含量较恒定。健康动物血糖水平为
80~120mg/dl。GOD-PAP法，即过氧化物酶—抗过氧化物酶法是近几年临床血糖定量测定的普遍方法。该法测定血糖依据的酶反应为：
Glu氧化酶(GOD)
葡萄糖 + O2 + H2O
葡萄糖酸 ＋ H2O2
过氧化物酶(POD)
2H2O2＋ 4-氨基氨替比林 +酚 醌亚胺 ＋ 4H2O
醌亚胺在A480nm~A550nm波长有最大吸收，所产生颜色的深浅与血清中葡萄糖的量成正比。在同样条件下，测定葡萄糖标准液和样品的吸收值，代入后面所给公式即可求出样品中葡萄糖的含量。
33
三、操作（见基础生化实验指导211页）
实验十 血液中谷丙转氨酶活力的测定
一、实验目的
1. 了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义。 2. 学习转氨酶活力测定的原理和方法。
二、实验原理
生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮基酸的α-酮基互换，在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。转氨酶的最适pH接近7.4，它的种类甚多，其中以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶）和谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶）的活力最强。它们催化的反应如下。 正常人血清中只含有少量转氨酶。当发生肝炎，心肌梗死等病患时，血清中转氨酶活力常显著增加，所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。
测定转氨酶活力的方法很多，本实验采用分光光度法。谷丙转氨酶作用于丙氨酸α-酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。丙酮酸2，4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色，可用分光光度法测定。从丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，可计算酶的活力。
三、试剂和器材
（一）器材 1.试管及试管架 2.吸管
3.恒温水浴 4.分光光度计 （二）试剂
1.0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4） 2.2.0μmol/ml丙酮酸钠标准溶液。
取分析纯丙酮酸钠11mg溶解于50ml磷酸缓冲液内 [当日配制]。 3.谷丙转氨酶底物。
取分析纯α-酮戊二酸29.2mg DL-丙氨酸1.78g克置于小烧杯内，加1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸调整pH至7.4后，加磷酸缓冲液至100ml。然后加氯仿数滴防腐。此溶液每毫升含α-酮戊二酸2.0μmol，丙氨酸200μmol。[在冰箱内可保存一周]。
4.2，4-二硝基苯肼溶液。
在200ml锥形瓶内放入分析纯2，4-硝基苯肼19.8mg，加100ml 1 mol/L盐酸。把锥形瓶放在暗处并不时摇动，待2，4-二硝基苯肼全部溶解后，滤入棕色玻璃瓶内置 [冰箱内保存]。
5.0.4mol/L氢氧化钠溶液。 6.人血清 [冰箱内保存。
四、操作方法
1.标准曲线的给制：取6支试管，分别标上0，1，2，3，4，5六个号。按下表所列的
34
次序添加各试剂。
试剂(ml) 丙酮酸钠标准液 谷丙转氨酶底物 磷酸缓冲液 （0.1mol/L,pH7.4） 试 管 号 0 - 0.50 0.10 1 0.05 0.45 0.10 2 0.10 0.40 0.10 3 0.15 0.35 0.10 4 0.20 0.30 0.10 5 0.25 0.25 0.10 2,4-硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙。底物中的α-酮戊二酸与2，4-二硝基苯肼反应，生成α-酮戊二酸苯腙。因此，在制作标准曲线时，须加入一定量的底物，（内含α-酮戊二酸）以抵消由α-酮戊二酸产生的消光影响。
先将试管置于37℃恒温水浴中保温10min以平衡内外温度。向各管内加入0.5ml2，4-二硝基苯肼溶液后再保温20min，最后，分别向各管内加入0.4mol/L氢氧化钠溶液5ml。在室温下静置30min，以0号管作空白，测定520nm的光吸收值。用丙酮酸的微摩尔数为横坐标，光吸收值为纵坐标，画出标准曲线。
2.酶活力的测定：取2支试管并标号，用第1号试管做为未知管，第2号试管做为空白对照管。各加入谷丙转氨酶底物0.5ml,置于37℃水浴内10min，使管内外温度平衡。取血清0.1ml加到第1号试管内，继续保温60min。到60min时，向两支试管内各加入2，4-二硝基苯肼试剂0.5ml，于37℃保温20min,然后再向2支管中加入0.4mol/L氢氧化钠溶液5ml。在室温下静置30min后，测定未知管的520nm波长光吸收值（显色后30min至2小时内其色度稳定）。在标准曲线上查出丙酮酸的微摩尔数。（用1μmol丙酮酸代表1.0单位酶活力）。计算每100ml血清中转氨酶的活力单位数。
35