Q/KM—ZJ— —2008
液体洗涤剂杀菌试验规程
（内部使用）
2008年 月 日内部执行
质量管理中心实验室
引用标准
1、GB15979-2002 一次性使用卫生用品卫生标准
2、QB/T2738-2005 日化产品抗菌抑菌效果的评价方法 3、QB/T2850-2007 抗菌抑菌型洗涤剂
4、 2002年版 《消毒技术规范》 (中华人民共和国卫生部) 5、2001年版
（科技出版社） 《药品微生物学检验手册》
杀菌率试验规程
1、试验菌、试验温度、作用时间、试液浓度
试验菌种：金黄色葡萄球菌（ATCC 6538），大肠杆菌（8099或ATCC 25922），白色念珠菌。 试验温度：20℃±1℃。
作用时间：最短不得小于30s。常规作用时间为2min、5min、10min、20min。 试液浓度：中和剂鉴定用试液浓度应为正式杀菌试验最高浓度。
菌悬液用量：正式杀菌试验用菌悬液的浓度、取量应与中和剂鉴定中1组、2组所用菌悬液的浓度、取量相同。
2、细菌繁殖体悬液、菌片的制备程序： 2.1菌悬液的制备
⑴ 取冻干菌种管，在无菌操作下，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吸吹数次，使菌种融化分散。取含5.0ml-10.0ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18h～24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养18h～24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37℃培养18h～24h，即为第3代培养物（放在4℃左右冰箱中保藏。每隔2-3个月移种一次，继续保藏。）。
⑵ 取第3代～14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（经18h～24h培养），用5.0ml吸管吸取3.0ml-5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中，在手掌上振敲80次（力度适中，勿溅出），以使细菌悬液均匀。或从新鲜菌种斜面沾取少量菌苔，接种在适合试验菌生长的培养基中，37℃培养18h～24h（或适宜时间）。作为原菌液。（源于《药品微生物学检验手册》211页）
⑶ 细菌繁殖体悬液应保存在4℃冰箱备用。尽量减少在室温下放置时间，以减少细菌的自然死亡。应当天使用不得过夜。
回收菌数为1×10～9×10cfu/ml 用PBS液配置 GB15979-2002 《一次性使用卫生用品卫生标准》 回收菌数为1×108—5×108cfu/ml用TSB营养肉汤配置—2002 《消毒技术规范》 2.2、菌片的制备程序：《消毒技术规范》
⑴ 取冻干菌种管，在无菌操作下，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吸吹数次，使菌种融化分散。取含5.0ml-10.0ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18h～24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养18h～24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37℃培养18h～24h，即为第3代培养物。
⑵ 取第3代～14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（经18h～24h培养），用5.0ml吸管吸取3.0ml-5.0mlTSB营养肉汤加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用5.0ml吸管将洗液移至另一
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无菌试管中，在手掌上振敲80次，以使细菌悬液均匀，含菌量1×108—5×108cfu/ml。
⑶用无菌镊子夹住已灭菌10mm*10mm滤纸一角，一面朝上，注入10ul菌悬液，放到无菌平板内，37℃温箱中干燥20min-30min，（或在室温自然阴干后使用）制成菌片。每个菌片回收菌落，按活菌培养计数所得结果，应为5×105—5×106cfu/片。）
⑷细菌繁殖体悬液和菌片，用毕应随时保存在4℃冰箱内。尽量减少在室温下放置时间，以减少细菌的自然死亡。（应当天使用不得过夜。） 3、操作程序
3.1、悬液定量法杀菌试验操作程序
⑴、 样品用无菌标准硬水稀释至同中和剂鉴定用试液浓度，或低于中和剂鉴定用试液浓度，制成（稀释液）试验样液。
⑵、 将试管按需要数量分别排列于试管架上，各组由左向右，排序、标记。
⑶、 配制菌悬液，浓度为1×104～9×104 cfu/ml—GB15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》或1×108—5×108cfu/ml—2002 《消毒技术规范》
⑷、 取杀菌试验用无菌大试管，先加入0.5ml试验用菌悬液，再加入0.5ml有机干扰物质，混匀，置20±1℃ 5min，用无菌吸管吸取步骤1中的试验样液4.0ml注入其中，立即开启计时器，并迅速混匀（在手掌上振摇80次）。-见《消毒技术规范》或吸取试验用菌悬液0.1ml，加入到含5ml样液的试管中，立即开启计时器，并迅速混匀（在手掌上振摇80次）。-见QB/T 2738-2005
⑸、 作用2min、5min、10min、20min，即刻用无菌吸管吸取0.5ml移入鉴定合格的4.5ml中和剂溶液中（中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同）充分混匀，中和作用10min后，取样液、10倍系列稀释液0.5ml（见GB15979-2002）或分别吸取1.0 ml （-见《消毒技术规范》）（见图四），置于2个灭菌平皿，用凉至40～45℃营养琼脂培养基或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15ml作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，35℃±2℃培养48h（细菌）或（酵母菌）25℃±2℃培养72h，作活菌菌落计数。
⑹、 同时用稀释液代替样液进行平行试验，作为阳性对照管。
⑺、 阴性对照组：分别吸取试验用相关溶液和培养基进行培养，观察有无污染。
⑻、 计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以菌落数在15cfu～300cfu的平板为准，每个稀释度3个平板生长菌落数全部合乎上述标准，则以该3个平板的菌落平均值作为结果；若有2个符合合乎上述标准，则以该合格的2个平板菌落的平均值作为结果。
⑼、 试验重复3次，求其平均值。根据各组活菌浓度（cfu/ml），计算杀菌率，见计算公式1。或根据各组活菌浓度换算为对数值（N），计算杀灭对数值，见计算公式2。 3.2 载体法杀菌试验操作程序
⑴、试验样品用无菌标准硬水（过滤除菌）稀释至规定浓度，制成（稀释液）试验样液。
⑵、吸取样液5.0ml放入灭菌平皿，另吸取PBS 5.0ml注入平皿中，作为阳性对照皿。每皿用无菌镊子
夹住菌片一角放入试样皿和阳性对照皿。
⑶、作用至设定时间后，即刻用无菌镊子夹住菌片一角，投入含5.0ml中和剂的试管中（中和剂的浓度
与容量应与鉴定试验结果规定的相同）充分混匀计时。(见图三)
⑷、中和10min后，取样液或10倍系列稀释液1.0ml（（见图四），置于两个灭菌平皿，接种凉至40～
45℃营养琼脂培养基或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15ml，转动平皿10-20下，使其充分均匀，凝固后，于35℃±2℃培养48h（细菌）或72h（酵母菌），作活菌菌落计数。 ⑸、试验重复3次，求其平均值。
⑹、阴性对照组：分别吸取试验用相关溶液和培养基进行培养，观察有无污染。 A、 PBC液（0.03mol/L磷酸盐缓冲液）、 B、 无菌标准硬水1ml置于灭菌平皿内、
C、 空白平皿，倾注营养琼脂培养基（细菌）或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15ml培养。
⑺、计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以菌落数在15cfu～300cfu的平板为准，每个稀释度3个平板生长菌落数全部合乎上述标准，则以该3个平板的菌落平均值作为结果；若有2个符合合乎上述标准，则以该合格的2个平板菌落的平均值作为结果。 4、计算公式
1、杀菌率X1＝（A － B ）/ A ×100% 式中：X1—杀菌率（%）； A--对照样品平均菌落数； B--被试样品平均菌落数。
2、杀灭对数值（KL）＝对照组平均活菌浓度的对数值（No）－试验组活菌浓度的对数值（Nx） 备注：计算杀灭对数值时，取小数点后两位值，可以进行数字修约。如果消毒试验组消毒处理后平均生产菌落数，小于等于1时，即大于等于试验前对照组平均活菌浓度的对数值。 5、评价标准
杀菌率≥90%，产品有杀菌作用。
悬液定量杀灭试验中，各次的杀灭对数值≥5.00，可判定为消毒合格。 6、操作要点：（消毒技术规范2002版）
1、
对接触消毒剂（杀菌剂）的样本，在达到规定作用时间，即刻取样移入鉴定合格的中和剂
溶液中（中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同）； 2、
即刻混匀，并按规定时间吸取样液进行随后的培养检测；