3、 在将样本接种培养基以前的操作，应按规定时间内进行，以免微生物与中和剂或中和产物
接触过久。
审核： 编制：
中和剂悬液定量鉴定试验操作程序
引用标准： QB/T2738-2005 日化产品抗菌抑菌效果的评价方法（试验菌悬液在1×104—9×104cfu/ml） GB 15979-2002 一次性使用卫生用品卫生标准（试验菌悬液在1×104—9×104cfu/ml） 2002 消毒技术规范（试验菌悬液在1×107—5×107cfu/ml）
一、定义和术语
中和剂—在微生物杀灭试验中，试验微生物与杀菌剂作用达到规定时间的终点时，用以中和残留的杀菌剂，使其不在持续抑制和杀灭微生物的试剂。
中和产物—中和剂加杀菌剂（样品）=9：1，作用10min配置而成。 二、中和剂鉴定试验原理
中和剂鉴定试验原理
试验分组 第1组 杀菌剂＋菌液→培养 第2组 （杀菌剂＋菌液）＋中和剂→培养 第3组 中和剂＋菌液→培养 第4组 （杀菌剂＋中和剂）＋菌液→培养 第5组 阳性菌数对照 第6组 阴性对照。 观察杀菌剂对试验菌有无杀观察残留杀菌剂被中和后，观察中和剂是否抑菌。 观察中和产物，或未被完全中和的残留杀菌剂对试验菌的生长繁殖是否有影响。 阳性对照组。 阴性对照组。 灭或抑制能力 受到杀菌剂作试验目的 用后的试验菌是否能恢复生长。
三、中和剂鉴定试验中易出现的问题及解决方法 1 出现的问题 解决方法 ①、②组无菌生长或②组平板上少于5个菌降低消毒剂浓度或缩短作用时间。 落，其它组正常。 2 ①②菌落数较多且数量基本相同，其它组正提高消毒剂浓度或延长作用时间。 常。 3 ③组中和剂菌落数明显少于PBS组菌数 降低中和剂浓度或改变中和剂成分。 4 ④组（中和产物）菌落数明显少于PBS组菌数，提高中和剂浓度或改变中和剂成分。 其它组正常。 5 多次更换中和剂均不能得到满意结果。 选用载体法进行中和剂鉴定，杀菌试验同时用载体法进行。 四、1鉴定试验操作程序
中和剂悬液定量鉴定试验操作程序-《消毒技术规范》 试验分组 第1组 第2组 第3组 第4组 第5组 取4.5ml PBS（稀释液）加入对应组 0.1ml菌悬液＋0.4ml硬水混匀 作用10min， 取0.5ml加入下列各对应组 中和剂 4.5ml 中和产物 4.5ml / PBS 4.5ml — — — — 第6组 — 取试验样品4.0ml加入各对应组 取4.5ml中和取4.9ml中剂加入对应和产物b加组 20℃±1℃恒温5min 菌悬液1.0ml 菌悬液1.0ml 0.1ml菌悬液＋0.4ml硬水混匀 振敲80 次， 混匀 作用至试验预定时间， 取0.5ml加入下列对应组 PBS 4.5ml 振敲80次、混匀 取适宜稀释度悬液1.0ml接种平板（2个/样本）
入对应组 0.1ml菌悬液 中和剂 4.5ml 作用10min / 活菌培养计数 活菌培养计数 用中和剂10用中和产物用稀释液10倍系列稀释 PBS＋中和剂 各1.0ml接种平板 倍系列稀释 10倍系列稀释
第1组不长中和剂鉴定评价规定 菌或明显少于第2组 第2组菌数大于5且明第3、4、5组菌数相似， 误差率≤15% 第6组无菌生长 显少于第3、三组间平均菌数=（第3+4+5组菌数）÷3； 4、5组 误差率%=（三组平均菌数-各组菌落平均数）的绝对值之和/3×三组间平均菌数×100 中和剂鉴定合格标准中对1、2组菌数要求。 结论 0 X（1-10） Y(＞10) ＞5 ＞(X＋5) ＞1.5 Y 符合上述评价的中和剂表明可消除试验样品对指示菌的作用，中和剂与试验样品的中和产物对指示菌无毒害，鉴定为该试验样品的中和剂。 a菌悬液浓度及制备：消毒技术规范用PBS（试验菌悬液在1×107—5×107cfu/ml） 备注 b中和产物的配置：先将试验样液1.0ml与中和剂溶液9ml混合，作用10min后制成
四、2 鉴定试验操作程序
中和剂鉴定试验操作程序-载体法 试验分组 用无菌镊子取第1组 吸取试验第2组 吸取试验样品5.0ml于无菌平皿内 第3组 第4组 第5组 吸取PBS 5.0ml于无菌第6组 — 吸取中和剂 吸取中和产5.0ml于无菌物5.0ml于平皿内 菌片加入下列样品5.0ml对应组 于无菌平皿内 无菌平皿内 平皿内 作用至预定时间，立即用无菌混匀作用10min，立即用无菌镊子取出菌片移入对应组 镊子取出菌片移入对应组 试管振打80次 PBS 5.0ml 中和剂 5.0ml 作用10min 用稀释液10倍系列稀释 中和剂 5.0ml 中和产物 5.0ml / 稀释液 5.0ml — 取原液或稀释液1.0ml接种平板（2个/样本） 操作要点
作用10min 用稀释液 10倍系列稀释 用中和剂10用中和产物用稀释液10倍系列稀释 稀释液＋中和剂 各1.0ml接种平板 倍系列稀释 10倍系列稀释 即刻混匀，并按规定时间接种培养基
中和剂鉴定评价 第1组不长菌或明评价规定 显少于第2组 第2组有且较第第3、4、5组菌数相似，且其误差率≤15% 第6组无1组为多，较第3、4、5组为少的菌数生长，并符合下表要求。 中和剂鉴定合0 ＞5 ＞(X＋5) ＞1.5 Y 三组间平均菌数=（第3+4+5组菌数）÷3； 误差率%=（三组平均菌数-各组菌落平均数）的绝对值之和/3×三组间平均菌数×100 菌生长 格标准中对1、X（1-10） 2组菌数要求。 结论 Y(＞10) 符合上述评价的中和剂表明可消除试验样品对指示菌的作用，中和剂与试验样品的中和产物对指示菌无毒害，鉴定为该试验样品的中和剂。 a菌悬液浓度及制备：用PBS将指示菌制成1×10～9×1044 cfu/ml悬液。（-GB15979） 备注 消毒技术规范用PBS（试验菌悬液在1×107—5×107cfu/ml） b中和产物的配置：先将试验样液1.0ml与中和剂溶液9ml混合，作用10min后制成 四、3 鉴定试验操作程序
中和剂悬液定量鉴定试验操作程序-《GB/T 15979》 试验分组 取0.10ml菌悬液,分别加入各组 振敲80 次， 混匀 作用至试验预定时间， 取0.5ml加入下列对应组 PBS 4.5ml 振敲80次、混匀 取适宜稀释度悬液1.0ml接种平板（2个/样本） 第1组 第2组 第3组 第4组 第5组 取5.0ml PBS（稀释液）加入对应组 第6组 — 取试验样品5.0ml加入各对应组 取5.0ml中和取5.0ml中剂加入对应和产物b加组 入对应组 作用10min， — 取0.5ml加入下列各对应组 中和剂 4.5ml 中和产物 4.5ml / PBS 4.5ml — — 中和剂 4.5ml 作用10min / 活菌培养计数 活菌培养计数 用中和剂10用中和产物用稀释液10倍系列稀释 PBS＋中和剂 各1.0ml接种平板 倍系列稀释 10倍系列稀释
第1组不长中和剂鉴定评价规定 菌或明显少于第2组 第2组菌数大于5且明第3、4、5组菌数相似， 误差率≤15% 第6组无菌生长 显少于第3、三组间平均菌数=（第3+4+5组菌数）÷3； 4、5组 误差率%=（三组平均菌数-各组菌落平均数）的绝对值之和/3×三组间平均菌数×100 中和剂鉴定合格标准中对1、2组菌数要求。 结论 0 X（1-10） Y(＞10) ＞5 ＞(X＋5) ＞1.5 Y 符合上述评价的中和剂表明可消除试验样品对指示菌的作用，中和剂与试验样品的中和产物对指示菌无毒害，鉴定为该试验样品的中和剂。 a菌悬液浓度及制备：用PBS将指示菌制成1×10～9×1044 cfu/ml悬液。（-GB15979） 备注 b中和产物的配置：先将试验样液1.0ml与中和剂溶液9ml混合，作用10min后制成
七、消毒剂的常用中和剂的配置
1、用于氯型杀菌剂（有效氯0.1-0.5%）：硫代硫酸钠 2、用于非氧化型杀菌剂：
a：磷酸二氢钾1.36g、磷酸氢二钠2.83g、卵磷脂10.0g、甘氨酸10.0g、吐温-80 30.0g、蒸馏水1000ml
b：磷酸二氢钾1.36g、磷酸氢二钠2.83g、卵磷脂3.0g、吐温-80 20.0g、蒸馏水1000ml 3、用于氧型杀菌剂：吐温-80 20.0g、硫代硫酸钠10.0g、PBS1000ml、 4、阳离子胍类消毒剂：卵磷脂3.0%、吐温-80 3.0%的PBS溶液 5、季胺盐类消毒剂（0.1-0.5%）：吐温-80 +卵磷脂（1.0-2.0%） 6、酚类（DP-300）消毒剂（3.0-5.0%）：吐温-80 （0.5-3.0%） 7、复方消毒剂：吐温-80 +卵磷脂+硫代硫酸钠 8、过氧乙酸（0.1-0.5%）：硫代硫酸钠（0.1-1.0%）） 9、过氧化氢（1.0-3.0%）：硫代硫酸钠（0.5-1.0%）） 八、附 悬液定量杀菌试验示意图、载体法试验杀菌率示意图