实验三 穿心莲中穿心莲内酯的提取、分离与鉴别
【实验目的】
1.掌握从穿心莲药材中提取亲脂性成分的原理和方法。 2.掌握除去叶绿素的原理和方法。
3.熟悉内酯类成分的主要理化性质及鉴别方法。 【实验原理】
1.穿心莲为爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees的全草。穿心莲中含有多种二萜类化合物，主要为穿心莲内酯、新穿心莲内酯、脱氧穿心莲内酯等。
（1）穿心莲内酯(andrographolide)。分子式C20H30O5，分子量350.44。无色方形或长方形结晶，味极苦。mp.230～231℃，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、吡啶中，微溶于氯仿、乙醚、难溶于水、石油醚、苯。
（2）新穿心莲内酯(neoandrographolide)。分子式C26H40O8，分子量480.58。无色柱状结晶，无苦味。mp.167～168℃，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、吡啶中，微溶于水，较难溶于苯、乙醚、氯仿及石油醚。
（3）去氧穿心莲内酯(deoxyandrographolide)。分子式C20H30O4，分子量334.44。无色片状（丙酮、乙醇或氯仿）或无色针状结晶（醋酸乙酯），味稍苦。mp.174～175℃。易溶于甲醇、乙醇、丙酮、吡啶、氯仿，可溶于乙醚、苯中，微溶于水。 D
（4）脱水穿心莲内酯(dehydroandrographolide) 分子式C20H28O4,分子量332.42。无色针状结晶（30%或50%乙醇），mp.204℃。易溶于乙醇、丙酮，可溶于氯仿，微溶于苯，几不溶于水。
1522.5
O1316OOOOHO201011OOOCH2HO1817CH2HOCH2OHCH2HOHCH2OHCH2OH19glcOCH2
穿心莲内酯 去氧穿心莲内酯 新穿心莲内酯 脱水穿心莲内酯
2.本实验是利用穿心莲内酯类成分易溶于甲醇、乙醇、丙酮等溶剂的性质，选用乙醇为提取溶剂进行提取。穿心莲中含有大量叶绿素，故用活性炭吸附，除去叶绿素等脂溶性杂质。又根据穿心莲内酯与去氧穿心莲内酯在氯仿中溶解度不同而进行分离。也可利用穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯及新穿心莲内酯结构上的差异所表现的极性不同，用氧化铝柱
色谱分离。
【实验仪器与试剂】
1.减压浓缩器，1000、500、100、10ml烧杯，10ml试管，试管架，托盘天平，量筒，三角漏斗，洗瓶，布氏漏斗，水浴锅，10×20cm薄层板，10×20cm薄层色谱缸，点样毛细管，紫外灯（仪），玻棒，牛骨匙，纱布，脱脂棉，显色剂喷瓶，小型空压机，超声波振荡器，层析柱（Ф1.5cm）
2.穿心莲粗粉，滤纸，pH试纸，活性炭，氯仿，中性氧化铝（柱层析用），7%盐酸羟胺甲醇溶液，氢氧化钾甲醇溶液，稀盐酸，1%三氯化铁溶液，0.3%亚硝酰铁氰化钠溶液，10%氢氧化钠溶液，碱性3,5-二硝基苯甲酸试剂，薄层用硅胶H，0.2%CMC-Na，甲醇，穿心莲内酯对照品，展开剂：①氯仿-甲醇（9∶1），②氯仿-正丁醇-甲醇（2∶1∶2）
【实验步骤】1.提取
方法Ⅰ： 穿心莲叶粗粉200g
加10倍量80%乙醇浸渍提取2次， 每次2天，滤过
滤液 药渣
浓缩至小体积
总浓缩液
加原料量15%～20%活性炭，加热回流30min 趁热滤过
滤液 活性炭渣
浓缩至原料量10%（V/W），静置析晶，滤过
内酯类结晶粗品
方法Ⅱ： 穿心莲叶粗粉200g
10倍量乙醇分3次超声波振荡提取， 每次30min，滤过
滤液 药渣 回收乙醇至500ml左右
总浓缩液
加原料量15%～20%活性炭，加热回流30min 趁热滤过 滤液 活性炭渣
浓缩至原料量10%（V/W），静置析晶，滤过
内酯类结晶粗品
2.精制
内酯类结晶粗品
不溶物 氯仿液
加15倍量95%乙醇溶解，加1%活 性炭回流30mi， 滤过
滤液 活性炭渣
回收乙醇至半，放冷析晶，滤过
氯仿冷浸溶解，滤过 内酯类结晶精制品
3.分离
内酯类结晶精制品
加少量氯仿溶解
氯仿溶液
中性氧化铝柱 氯仿洗脱 氯仿-无水乙醇（9.6∶0.4）洗脱 去氧穿心莲内酯 粗晶
95%乙醇重结晶
50%乙醇洗脱 新穿心莲内酯
穿心莲内酯
4.穿心莲内酯类成分的检识
（1）异羟肟酸铁反应 取穿心莲内酯结晶数毫克，加乙醇1ml溶解，加7%盐酸羟胺甲醇溶液2～3滴，加10%氢氧化钾甲醇溶液1～2滴使呈碱性，于水浴上加热2分钟，放冷后，加稀盐酸使呈酸性，加1%三氯化铁溶液1～2滴，混匀，呈紫红色。
（2）Legal反应 取穿心莲内酯结晶少许，加乙醇1ml溶解，加0.3%亚硝酰铁氰化钠溶液2～4滴，加10%氢氧化钠溶液1～2滴，呈紫色。
（3）Kedde反应 取穿心莲内酯结晶少许，加乙醇1ml溶解，加碱性3,5-二硝基苯甲酸试剂2滴，呈紫色。
（4）穿心莲内酯类成分的薄层色谱检识 薄层板：硅胶H-CMC-Na
试 样：自制穿心莲内酯乙醇溶液 对照品：穿心莲内酯对照品乙醇溶液 展开剂：①氯仿-甲醇（9∶1）
②氯仿-正丁醇-甲醇（2∶1∶2）
显色剂：喷雾Kedde试剂，加热显色
【基本操作注意事项】
1.穿心莲内酯类化合物为二萜类内酯，性质极不稳定，易氧化、聚合而树脂化。因此提取所用的穿心莲应是当年产的新药材，并且要未受潮变质的茎叶部分，否则内酯含量明显下降至极低，难以提取得到。
2.提取时，如用热乙醇加热回流提取穿心莲总内酯，能同时提出大量穿心莲中的叶绿素、树脂以及无机盐等杂质。使析晶和精制较为困难，因此本实验用冷浸法和超声波振荡法提取。
3.以超声波振荡法提取省时，浓缩析晶时脂溶性杂质少，易得到黄色结晶，得率高。 4.穿心莲内酯的析晶宜在含乙醇量稍高的情况下进行，此时晶形与结晶的纯度都较好。当溶液的含水量较高，或粘稠度太大时，往往不易析出结晶。
【思考题】
1.叶绿素除用活性炭吸附法去除外，还可采用哪些方法去除？ 2.穿心莲总内酯的分离可采用哪些方法？试比较各种方法的优缺点。
3.根据穿心莲内酯类成分的结构，试判断其极性的强弱，在进行吸附薄层色谱时其Rf值大小如何？
4.Legal反应和Kedde反应的机理是什么？什么样的结构才有阳性反应？
实验四 八角茴香挥发油的提取及鉴别
【实验目的】
1.掌握挥发油的水蒸气蒸馏提取法。
2.掌握挥发油中化学成分的薄层点滴定性检识。 3.熟悉挥发油的一般检识。
4.了解挥发油单向二次薄层色谱检识。 【实验原理】
1.为木兰科植物八角茴香Illicium verum Hook..f.的干燥成熟果实。分布于广西、贵州、云南等省区。含挥发油4％～9％，脂肪油约22％（主要存在于种子中）及蛋白质、树胶、树脂等。挥发油中主要成分是茴香醚，约为总挥发油的80％～90％，冷时常自油中析出，故称茴香脑。此外，尚含莽草酸及少量甲基胡椒酚、茴香醛、茴香酸等。
OCH3COOHOCH3CHOCOOHHOCHCHCH3OHOH
CH2CHCH2
OCH3
OCH3
茴香醚（脑） 甲基胡椒酚 茴香醛 莽草酸 茴香酸
（1）茴香脑(anethole) 又称大茴香醚、茴香烯、茴香醚。分子式C10H12O，分子量148.21。为白色结晶，mp.21.4℃，bp.235℃。与乙醚、氯仿混溶，溶于苯、醋酸乙酯、丙酮、二硫化碳及石油醚，几不溶于水。
（2）莽草酸(shikimic acid) 又称毒八角酸。分子式C7H10O5,分子量174.15。无色针状结晶（甲醇—醋酸乙酯），mp.190～191℃。在100ml水中可溶解18g，100ml无水乙醇中可溶解2.5g，几乎不溶于氯仿、苯、石油醚。
（3）甲基胡椒酚(methylchavicol) 分子式C10H12O，为无色液体，bp.215～216℃。 （4）茴香醛 (anisaldehyde) 分子式C8H8O2，有两种状态：棱晶，mp.36.3℃，bp.236℃；液体，mp.0℃，bp.248℃。
（5）茴香酸 (anisic acid) 分子式C8H8O3，针状结晶，mp.184℃，bp.275～280℃。 2.本实验是水蒸气蒸馏法提取挥发油的通法。挥发油的组成成分较复杂，常含有烷烃、烯烃、醇、酚、醛、酮、酸、醚等官能团。因此可以用一些检出试剂在薄层板上进行点滴试验，从而了解组成挥发油的成分类型。挥发油中各类成分的极性互不相同，一般不含氧的烃类和萜类化合物极性较小，在薄层色谱板上可被石油醚较好的展开；而含氧的烃类和萜类化合物极性较大，不易被石油醚展开，但可被石油醚与醋酸乙酯的混合溶剂较好的展