二、（1）大黄中5种羟基蒽醌化合物的酸性和极性大小应如何排列？为什么？ （2）pH梯度萃取法的原理是什么？适用于哪些中药成分的分离？ （3）蒽醌类化合物及其苷的薄层色谱用什么作吸附剂、展开剂和显色剂？ （4）蒽醌类与乙酸镁显色反应的必要条件是什么？其颜色反应与羟基所在的位置有何关系？
实验五 苦参生物碱的提取、分离与鉴别
【实验目的】
1.掌握用离子交换树脂提取、分离生物碱的原理和方法。 2.掌握苦参生物碱的提取、分离与鉴别 3.学习离子交换树脂的处理与再生方法。
【实验原理】
1.苦参中生物碱主要是苦参碱和氧化苦参碱。除此之外还含有羟基苦参碱(hydroxymatrine)、N-甲基金雀花碱(N-methylcytisine)等多种生物碱。分子结构中均有两个氮原子，一个为叔胺，一个为酰胺。
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苦参碱 氧化苦参碱 羟基苦参碱 N-甲基金雀花碱 苦参中的生物碱具有多方面的生理活性。现代临床及药理学研究表明，总生物碱具有消肿利尿、抗肿瘤、抗病原体作用，同时具有抗心率失常、正性肌力、抗缺氧、扩张血管、降血脂、抗柯萨奇病毒、调节免疫等作用。临床上除治疗常规疾病外，还用于治疗心率失常、心力衰竭、病毒性心肌炎、冠心病等。
（1）性状 苦参碱有α-、β-、γ-、δ-四种形态。其中α-、β-、δ-苦参碱为结晶体，γ-苦参碱为液体。常见的是α-苦参碱，为针状或棱柱状结晶，mp.76 ℃。氧化苦参碱为无色正方体状结晶（丙酮），mp.207 ～208℃（分解）。含一分子结晶水的氧化苦参碱mp.77 ～78 ℃。
（2）溶解性 苦参碱既可溶于水，又能溶于氯仿、乙醚、苯、二硫化碳等亲脂性溶剂。氧化苦参碱是苦参碱的N-氧化物，具有半极性配位键，其亲水性比苦参碱更强，易溶于水，可溶于氯仿，但难溶于乙醚。可利用二者在乙醚中的溶解性差异进行分离。苦参中生物碱的极性大小顺序是：氧化苦参碱＞羟基苦参碱＞苦参碱。
（3）水解性及氧化还原反应 苦参碱、氧化苦参碱和羟基苦参碱具有内酰胺结构，可水解生成羧酸衍生物，酸化后又脱水环合为内酰胺结构。如苦参碱在5% KOH中加热，水解成苦参酸钾，酸化后又环合为苦参碱。N-甲基金雀花碱是芳香性的内酰胺碱，稳定性
大，在同样水解条件下不易水解生成钾盐，可利用这一性质与苦参碱分离。
在植物体内，70%以上苦参碱以氧化苦参碱状态存在。
2.苦参中生物碱主要有苦参碱和氧化苦参碱。分子结构中均有两个氮原子，一个为叔胺，一个为酰胺。苦参生物碱可与酸结合成盐，因此用酸水提取后，生物碱呈阳离子状态而被阳离子交换树脂所交换，再用氨水碱化后使生物碱游离，用有机溶剂回流提取之。
苦参碱既可溶于水，又能溶于氯仿、乙醚、苯、二硫化碳等亲脂性溶剂。氧化苦参碱是苦参碱的N-氧化物，易溶于水，可溶于氯仿，难溶于乙醚。也可利用二者在乙醚中的溶解性差异进行分离。氧化苦参碱的极性大于苦参碱。
【实验仪器与试剂】
1.索氏提取器，参漉筒，阳离子交换树脂，500、100、10ml烧杯，10ml试管，试管架，托盘天平，量筒，三角漏斗，洗瓶，布氏漏斗，水浴锅，10×20cm薄层板，10×20cm薄层色谱缸，点样毛细管，紫外灯（仪），玻棒，牛骨匙，脱脂棉，显色剂喷瓶，小型空压机，层析柱（Ф1.5cm）
2.苦参粗粉，滤纸，pH试纸，2mol/L盐酸，浓盐酸，丙酮，改良碘化铋钾试剂（临时配用），薄层用硅胶H，0.2%CMC-Na，0.2%氢氧化钠，甲醇，苦参碱、氧化苦参碱对照品，苦参碱展开剂：甲苯－乙酸乙酯－甲醇－水（2:4:2:1）10℃下放置的上层溶液，氧化苦参碱展开剂：氯仿-甲醇－浓氨试液（5:0.6:0.3）10℃下放置的下层溶液，2mol/LNaCl，无水硫酸钠。
【实验步骤】
1.树脂的处理 由于市售的阳离子交换树脂为钠型，同时含水量不足未充分膨胀，而且往往含有杂质。因此使用前须进行转型、除杂和吸水膨胀处理，其方法如下：
取市售阳离子交换树脂（如聚苯乙烯磺酸型树脂，交联度1×7）120g，置烧杯中，加蒸馏水洗至水色较浅，再加蒸馏水浸泡树脂并在80℃水浴上加热1h（或室温下浸泡1天），以便树脂充分膨胀。减压抽干后加入2mol/LHCl200mL，不断搅拌，浸泡1h，倾去酸水，再加2mol/LHCl 400mL浸泡过夜。将树脂装入色谱柱中，再将浸泡用的2mol/LHCl全部通过树脂（4～5mL/min），然后用蒸馏水洗至pH4～5，备用。
2.苦参生物碱的提取和交换 取苦参粗粉100g，加适量0.1%HCl湿润膨胀后，装入渗漉筒中，以0.1%HCl1500mL渗漉，流速2～3mL/min。渗漉筒与交换柱相联，渗漉液通过装
有湿重60g树脂的阳离子交换柱交换，交换速度为2～3mL/min，测定不同交换时间的pH变化。然后将吸附树脂倒入烧杯中，以蒸馏水洗至洗液无色，抽干后置搪瓷盘中室温晾干。
3.总生物碱的洗脱 将上述晾干的树脂置烧杯中，加入适量10%氨水，搅匀，以手摸有潮湿感但不粘手为宜。放置20min，装入滤纸袋中置索氏提取器中，以氯仿连续回流提取至提取液无生物碱反应（取提取液中部的氯仿液滴在滤纸上喷改良碘化铋钾试剂）。氯仿液加无水硫酸钠脱水后，回收氯仿至干。残留物用丙酮20mL回流溶解，必要时抽滤，然后回收2/3的丙酮，放置，结晶，抽滤，干燥，即得粗品总碱的白色结晶。
4.薄层鉴定
吸附剂：0.2%氢氧化钠制硅胶H-CMC-Na板二块。 样品液：总碱乙醇液（每1mL含0.5mg），点样5μL。
标准品：苦参碱对照品乙醇液（每1mL含0.5mg），氧化苦参碱对照品乙醇液（每1mL含0.5mg），分别点样5μL。
苦参碱展开剂：甲苯－乙酸乙酯－甲醇－水（2:4:2:1）10℃下放置的上层溶液。 氧化苦参碱展开剂：氯仿-甲醇－浓氨试液（5:0.6:0.3）10℃下放置的下层溶液。 显色剂：依次喷碘化铋钾试液和亚硝酸钠乙醇试液，显橙色斑点。 结果：记录对照样品斑点和对照品斑点的颜色和位置，计算Rf值。
5.树脂再生 使用过的树脂用蒸馏水洗去杂质并抽干。然后以2mol/LHCl浸泡后装柱，使酸液通过树脂进行交换，再用水洗去酸液。接着再用1～2mol/LNaOH（或NaCl）进行交换，再用水洗去碱液，复用2mol/LHCl浸泡后通过树脂，用水洗去酸液后即可再用。树脂不用时应加水，保存在广口瓶中。
【基本操作注意事项】
1.苦参粗粉过10目筛即可，不宜太粗或太细。
2.树脂使用前应用水充分膨胀，否则交换效率低，重现性差。 3.喷改良碘化铋钾试液前薄层板上残留展开剂要挥干。
【思考题】
一、苦参生物碱的提取分离方法还有哪，同时注意实验成本、仪器、安全、环保等多因素思考。
二、（1）离子交换树脂分离苦参生物碱的基本原理是什么？
（2）为什用氢氧化钠制硅胶板？为什么苦参碱、氧化苦参碱用不同的展开剂？二者的展开剂交换使用结果会怎样？
（3）树脂再生应注意什么问题？