开。为了使挥发油中各成分能在一块薄层色谱板上进行分离，常采用单向二次色谱法展开。
【实验仪器与试剂】
1.100、10ml烧杯，250ml三角烧瓶，10ml试管，试管架，托盘天平，量筒，洗瓶，蒸馏装置，电热套，10×20cm薄层板，10×20cm薄层色谱缸，点样毛细管，紫外灯（仪），玻棒，牛骨匙，显色剂喷瓶，小型空压机。
2.八角茴香粗粉，滤纸，三氯化铁试剂，2,4-二硝基苯肼试剂，碱性高锰酸钾试剂，香草醛-浓硫酸试剂（临时配用），0.05%溴酚蓝试剂，硝酸铈铵试剂，柠檬油，丁香油，薄荷油，樟脑油，桉叶油，松节油，丙酮，石油醚（30～60℃），醋酸乙酯。
【实验步骤】 1.茴香脑的提取分离
取八角茴香粗粉50g，置圆底烧瓶中，加适量水浸泡湿润，按一般水蒸气蒸馏法进行蒸馏提取。也可将捣碎的八角茴香置于挥发油测定器的烧瓶中，加蒸馏水500ml与数粒玻璃珠，连接挥发油测定器与回流冷凝管，自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，并使溢流入烧瓶时为止。缓缓加热至沸，至测定器中油量不再增加，停止加热，放冷，分取油层。将所得的八角茴香油置冰箱中冷却1小时，即有白色结晶析出，趁冷滤过，用滤纸压干。结晶为茴香脑，滤液为析出茴香脑后的八角茴香油。
2.检识
（1）油斑试验 取八角茴香油适量，滴于滤纸片上，常温下（或加热烘烤），观察油斑是否消失。
（2）薄层色谱板点滴反应 取硅胶G薄层色谱板1块，用铅笔按表画线。将挥发油试样用5～10倍量乙醇稀释后，用毛细管分别滴加于每排小方格中，再将各种检识试剂用滴管分别滴于各挥发油试样斑点上，观察颜色变化。初步推测每种挥发油中可能含有化学成分的类型。
实-表1 挥发油薄层板点滴反应 试剂 试样 八角茴香油 柠檬油 丁香油 薄荷油 樟脑油 桉叶油 松节油 空白对照
1 2 3 4 5 6 试剂
1．三氯化铁试剂 2．2,4-二硝基苯肼试剂 3．碱性高锰酸钾试剂 4．香草醛-浓硫酸试剂 5．0.05％溴酚蓝试剂 6．硝酸铈铵试剂
（3）挥发油薄层色谱单向二次展开检识 取硅胶H-CMC-Na薄层板（6cm×15cm）一块，在距底边1.5cm及8cm处分别用铅笔画起始线和中线。将八角茴香油溶于丙酮，用毛细管点于起始线上呈一长条形，先用石油醚（30～60℃）-醋酸乙酯（85∶15）为展开剂展开至薄层板中线处取出，挥去展开剂，再放入石油醚（30～60℃）中展开至接近薄层板顶端时取出，挥去展开剂后，分别用下列几种显色剂喷雾显色。
①1％香草醛-硫酸试剂：可与挥发油产生紫色、红色等。 ②荧光素-溴试剂：如产生黄色斑点，表明含有不饱和化合物。 ③2,4-二硝基苯肼试剂：如产生黄色斑点，表明含有醛或酮类化合物。 ④0.05％溴甲酚绿乙醇试剂：如产生黄色斑点，表明含有酸性化合物。
观察斑点的数量、位置及颜色，推测每种挥发油中可能含有化学成分的种类及数量。
【基本操作注意事项】
1.通过观察馏出液的混浊程度来判断挥发油是否提取完全。最初的馏出液中含油量较多，明显混浊，随着馏出液中油量的减少，混浊度也随着降低，至馏出液变为澄清甚至无挥发油气味时，停止蒸馏。
2.提取完毕，须放冷，待油水完全分层后，再将油层放出，尽量不带出水分。 3.进行单向二次展开时，先用极性较大的展开剂展开至中线，然后再用极性较小的展开剂展开。在第一次展开后，应将展开剂完全挥干，再进行第二次展开，否则将影响第二次展开剂的极性，从而影响分离效果。
4.挥发油易挥发逸失，因此进行色谱检识时，操作应迅速及时，不宜久放。 5.喷洒香草醛-浓硫酸显色剂时，应于通风橱内进行；用溴甲酚绿试剂显色时，应避免在酸性条件下进行。
【思考题】
1.从八角茴香中提取分离茴香脑的原理是什么？ 2.利用点滴反应检识挥发油的组成优点是什么？
3.单向二次展开薄层色谱法检识挥发油中各成分时，为什么第一次展开所用的展开剂极性最好大于第二次展开所用的展开剂的极性？单向二次展开薄层色谱法有什么优点？
实验五 大黄中蒽醌苷元的提取、分离与鉴别
【实验目的】
1.掌握从大黄中提取和分离游离蒽醌的方法。
2.掌握用pH梯度萃取法分离不同酸性的羟基蒽醌类化合物。 3.掌握蒽醌类化合物的主要检识方法。 4.熟悉蒽醌类化合物的色谱检识方法。 5.了解用柱色谱法分离蒽醌类成分。 【实验原理】
1.大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄R.tanguticum Maxim. ex Reg.和药用大黄R. officinale Baill.的干燥根及根茎。大黄中含有大黄蒽醌及其苷。
（1）大黄酸(rhein) 分子式C15H8O6，分子量284.21。黄色针状结晶（升华法），mp.321～322℃，330℃分解。能溶于碱水、吡啶，溶于乙醇、氯仿、乙醚和石油醚，几不溶于水。
（2）大黄素(emodin) 分子式C15H10O5，分子量270.23。橙色针状结晶(乙醇)，mp.256～257℃，能升华。易溶于乙醇、碱水，微溶于乙醚、氯仿，几不溶于水。
（3）芦荟大黄素(aloe-emodin) 分子式C16H10O5，分子量270.23。橙色针状结晶（甲苯），mp.223～224℃。易溶于热乙醇，可溶于乙醚和苯，并呈黄色；溶于碱液呈红色；氨水及硫酸中呈绯红色。
（4）大黄酚(chrysophanol) 分子式C15H10O4，分子量254.23。橙黄色六方形或单斜结晶（乙醇或苯），mp.196～197℃，能升华。易溶于沸乙醇，可溶于丙酮、氯仿、苯、乙醚和冰醋酸，极微溶于石油醚、冷乙醇，几不溶于水。
（5）大黄素甲醚(physcion) 分子式C16H12O5，分子量284.26。砖红色单斜针状结晶，mp.203～207℃，溶于苯、氯仿、吡啶及甲苯，微溶于醋酸及醋酸乙酯，不溶于甲醇、乙醇、乙醚和丙酮。
OHOOHR2OR1大黄酚 R1=CH3 R2=H
大黄素 R1=CH3 R2=OH 大黄酸 R1=COOH R2=H
大黄素甲醚 R1=CH3 R2=OCH3 芦荟大黄素 R1=CH2OH R2=H
2.本实验是根据大黄中的羟基蒽醌苷经酸水解成游离羟基蒽醌，而游离羟基蒽醌不溶于水，可溶于氯仿、乙醚等亲脂性有机溶剂的性质，用氯仿从水解液中将游离羟基蒽醌提取出来，再利用各游离羟基蒽醌的酸性不同，采用pH梯度萃取法将其分离。其中大黄酚和大黄素甲醚的酸性十分近似，用pH梯度萃取法难以分离，可利用两者的极性不同，采
用硅胶柱色谱法进行分离。
【实验仪器与试剂】
1.索氏提取器，500、100、10ml烧杯，1000、500ml分液漏斗，10ml试管，试管架，托盘天平，量筒，三角漏斗，洗瓶，布氏漏斗，水浴锅，10×20cm薄层板，10×20cm薄层色谱缸，点样毛细管，紫外灯（仪），玻棒，牛骨匙，脱脂棉，显色剂喷瓶，小型空压机，层析柱（Ф1.5cm）
2.大黄粗粉，滤纸，pH试纸，乙酸乙酯，石油醚（60～90℃），氯仿，20％硫酸，pH8缓冲液，pH9.9缓冲液，浓盐酸，5％碳酸钠，5％氢氧，丙酮，10％氢氧化钠，0.5%醋酸镁乙醇试剂，薄层用硅胶H，0.2%CMC-Na，甲醇，大黄酸、大黄素、芦荟大黄素对照品，展开剂：石油醚（30～60℃）-乙酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）上层溶液，浓氨水。
【实验步骤】 1. 提取与分离
大黄粗粉100g
加20％硫酸200ml，加热回流3小时，放冷， 加乙酸乙酯300ml＋石油醚100ml，振摇，滤过
乙酸乙酯、石油醚提取液 药渣
水洗余酸至中性
乙酸乙酯、石油醚提取液
加pH8缓冲液150ml萃取 碱水液 乙酸乙酯、石油醚提取液
盐酸调pH3，静置，滤过 加pH9.9缓冲液300ml萃取 沉淀
冰醋酸精制 乙酸乙酯、石油醚提取液 碱水层
大黄酸
5％碳酸钠-5％氢氧 盐酸调pH3，滤过
化钠（9∶1）540ml 沉淀 萃取 丙酮精制
大黄素
乙酸乙酯、石油醚提取液 碱水层
3％氢氧化钠500ml萃取 盐酸调pH3，滤过
沉淀
碱水层 乙酸乙酯、石油醚提取液 醋酸乙酯精制
盐酸调pH3，滤过 芦荟大黄素
沉淀
硅胶柱色谱
大黄酚 大黄素甲醚
2．检识
（1）碱液试验 分别取各蒽醌化合物结晶少许，置试管中，加1ml乙醇溶解，加数滴10％氢氧化钠试剂振摇，观察颜色变化，羟基蒽醌应显红色。
（2）乙酸镁试验 分别取各蒽醌化合物结晶少许，置试管中，加1ml乙醇溶解，加数滴0.5％乙酸镁乙醇试剂，观察颜色变化，羟基蒽醌应显橙、红、紫等颜色。
（3）薄层色谱检识 薄层板：硅胶H-CMC-Na
试 样：自制大黄酸、大黄素、芦荟大黄素的乙醇溶液。 对照品：上述各成分对照品乙醇溶液（约1mg/ml）。
展开剂：石油醚（30～60℃）-乙酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）上层溶液。
显 色：在可见光下观察，记录黄色斑点的位置。然后再用浓氨水熏蒸或喷雾5％乙酸镁甲醇溶液，斑点应显红色。
【基本操作注意事项】
1.大黄中蒽醌类化合物的种类、含量与大黄的品种、采集季节、炮制方法及贮存时间均有关系，实验用药材应注意。
2.萃取用pH8缓冲液为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液 ；pH9.9缓冲液为碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液。配制好的缓冲液要测pH值。一般萃取大黄酸用pH7～8范围的，萃取大黄素用pH9.5～11范围的。
3.用各缓冲液进行萃取时，采用一次性加入的方法，实验证明，如将缓冲液分次萃取，分离效果不理想。
4.本实验也适应于以虎杖为原料的提取，但虎杖中不含大黄酸，故直接由大黄素开始分离。
5.色谱分离大黄酚及大黄素甲醚时，先用氯仿洗脱至出现黄色色带时，改用氯仿—醋酸乙酯（8∶2）混合溶剂继续洗脱，并更换收集器，每10ml为一份，按顺序编号，直至色谱柱的第一色带全部洗脱下来为止。各流分经硅胶-CMC-Na板，氯仿－醋酸乙酯(8∶2)展开，用大黄酚和大黄素甲醚作对照，合并斑点相同流分，分别浓缩、放置析晶，即可获得大黄酚及大黄素甲醚。
【思考题】
一、大黄游离蒽醌的提取分离方法还有哪，同时注意实验成本、仪器、安全、环保等多因素思考。