实验室常用技术资料
Lab. experiment technology
LQ
细胞冻存
1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射30min；吹打管、中枪头、中枪、培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入1.5ml胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心1000r/min，8分钟。(可以留下一部分细胞悬液在培养瓶中继续培养) 5. 用中枪吸去上清液直至冻存管内剩余1ml培养液，加入110ulDMSO(二甲基亚枫)，用枪头轻轻吹打使细胞均匀。
6. 冷存管置于4℃30min----20℃30min----80℃16～18小时(或隔
夜)---液氮槽长期储存。(-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些)。
7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。
细胞复苏
冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常。
1 材料：37℃ 恒温水浴箱，新鲜培养基，无菌吸管/ 离心管/ 培养瓶 2 步骤：
1、操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。 2、自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。
3、取出冷冻管，立即放入37 C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化。
4、常温离心1000rpm，5min，以70% 酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内，去除上清夜，加入新鲜培养基，重悬细胞。
5、取出细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养瓶，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。
G418和筛选
1、筛选之前由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。 1.G418的配制：取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。 2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量（10000个/ml）接种入24孔培养板中，过夜培养，开始加药。
3.制备筛选培养基：在100ug/ml～1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml、400ug/ml。。。。1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。 4.加G418筛选:吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。
5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。方法同4。
6.确定最佳筛选浓度：在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。一般400-８００左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。 2、确定了最佳筛选浓度后做稳定转染
1、转染：选取对数生长期细胞，接入平皿（4X105个/ml,5ml）,转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，接入12孔板，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合。
2、加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。
3、换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。筛选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大。 4、挑单克隆：显微镜下观察单克隆，加入胰酶消化，将单克隆吸入96孔板（每孔接1个克隆），加培养液继续培养。待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。（及早冻存）
5、单克隆鉴定：细胞大量扩增后，提取总RNA，做RT-PCR检测目的基因是否存在。
Lf2000转染：质粒DNA转染
转染前应筛选合适的DNA:Lf2000转染比例。一般按照1:1，2:1，3:1进行筛选。选择转染比率最高者为合适比例。筛选合适的细胞汇合度，看高汇合度还是低汇合度转染效率高。筛选时注意观察最佳转染时间。
以下操作以24孔板为例：
1、 贴壁细胞： 转染前一天，去不含抗生素的培养液500ul接于培养板(细胞密度0.5-2X105个/ml)，转染时细胞融合可到90-95%。
悬浮细胞：准备转染前取即可，取500ul细胞悬液（4-8X105 个/ml），培养液不含抗生素。 2、 准备混合物：
A：将DNA稀释于50ulOpti中，轻柔混匀。
B：使用前轻柔混匀Lf2000，取合适剂量用50ulOpti 稀释， 室温放置20min(注意：到stepC时要在25min内完成)。 C：加入A和B，轻柔混匀，室温放置20min.
3、 每孔中加入100ul混合物，前后晃动培养板，轻柔混匀。 4、 培养箱培养18-48h，转然后4-6h换液。
PBS配制 500ml
NaCl 4g KCl 0.1g Na2HPO4.12H2O 1.7907g
KH2PO4 0.12g
用400ml蒸馏水溶化，HCL/NaOH调PH至7.3-7.4，加水至500ml,高压灭菌。 胰酶配制
1、PBS 500ml 胰酶 1.25g EDTA 0.1g
搅拌4h
2、滤膜、滤纸用双蒸水浸泡2h,
3、装好滤器，勿按紧，包好，晾干后高压。 4、略烤干 5、层流室过滤
6、分装到高压过的小瓶
7、-20C保存备用，同时做无菌试验。
CuSO4配制
2% CuSO4 1500ml 硫酸铜 30g 双蒸水 1500ml
高压灭菌后，将液体倒入37C恒温箱。
双抗配制
青霉素 100u/ml培养液，链霉素100ug/ml培养液 青霉素 100万单位 链霉素 1g PBS 100ml
配制后浓度为10000u/ml，使用时取10ul/ml培养液。 电泳缓冲液TAE配制 贮存液（50X），1 L Tris 碱 242g 冰乙酸 57.1ml
0.5mol/l EDTA(PH8.0) 100ml 加水定容至1L
ALB培养基配制（400ml）
细菌培养用蛋白胨 4g 细菌培养用酵母提取物 2g 氯化钠 4g
预先在三角烧瓶中加入200ml双蒸水，将上述配方加入其中，搅拌。
5mol/L NaOH调PH至7.4.，加入双蒸水定容至400ml。取200ml做固体培养基装入A瓶，200ml做液体培养基。
称取3g琼脂加入A瓶。另取一小瓶，加入100ml双蒸水（配氨苄）。 将以上三瓶液体高压，15psi,20min。 配氨苄，过滤除菌。
待A、B瓶冷却至50oC，照100ug/ml浓度的氨苄，每瓶加入200ul，之后将A瓶液体倒入培养皿中，将B瓶和培养皿（倒置）贮存于4 oC。
注：溶液尚未冷却时，轻轻转动，使溶解的琼脂均匀分布，应避免产生气泡。使用前1-2小时应取出贮存的平皿。