细胞组织RNA提取（整个过程在冰上进行）
一、溶解细胞
（1） 贴壁细胞：吸去瓶内培养液，PBS冲洗两遍，加入胰酶消化，吸去胰酶加入PBS吹打，
制成细胞悬液，将悬液移入EP管，离心1000 rpm,10min，弃上清。加入Trizol 1ml。反复吹打，使沉淀溶解。（可以先加上500ul吹打，再加500ul充分混匀）
（2） 悬浮细胞：将细胞离心，加入Trizol反复吹打，使沉淀溶解。Trizol量为1ml/5-10X106
个细胞（动植物及酵母）或1ml/1X107个细菌。
（3） 组织：将组织切成小块（100mg），PBS冲洗干净，装入EP管，剪碎（非常碎，剪成
组织悬液，时间可稍长些），加入上500ulTrizol吹打使组织溶解，再加500ul充分混匀。
二、水相与有机相的分离
将上述所得液体于室温放置5min以使蛋白体解离，加入氯仿(0.2ml/ml Trizol),盖上管 盖，剧烈震荡（不要用振荡器）15s，室温放置2-3min。2-8OC下离心12000rpmX15min,离心后液体分三相：下层红色的酚-氯仿相，中间及上层水相。RNA全部位于水相，体积约占加入Trizol的60%。 三、沉淀RNA
将水相移入新的EP管（若要是提取DNA或蛋白质保留有机相）加入异丙醇（0.5ml/ ml Trizol）,-20OC放置90min（可过夜），2-8OC离心12000rpmX10min，可见管底部凝胶状沉淀，即为RNA。 四、洗涤RNA
用75%酒精（1ml/ml Trizol）冲洗沉淀，2-8OC离心7500rpmX5min,弃上清。将所得沉淀置于空气或真空（操作台内）中，干燥（注意不要过干，过干RNA难以溶解）。加入不含Rnase
O
的水或0.5%SDS溶液溶解RNA。琼脂糖凝胶电泳检测。-20C保存。
反转录
RNA 3ul(量可改变)
OLIGO 1ul 65OC水浴，5min H2O 5ul(量可变) 冰上静置1min 5Xbuffer 4ul Rninhibitor 1ul
DNTP 2ul 全部取好混匀后再分加 M-MVLV 1ul
混匀，瞬离，42OC水浴60min 70OC水浴5min,终止反应
PCR
H2O 12.2ul
Buffer 2.5ul 19.2ul DNTP 2.5ul MgCL2 2ul
上游引物 0.75ul 25ul 下游引物 0.75ul TAQ 0.3ul cDNA 4ul
石蜡封口，用PCR仪器，设定PCR条件。待反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测基因表达。 ATF5PCR条件： 94OC 5min 94OC 30s
55OC 30s 35cycle 72OC 30s 72OC 10min
琼脂糖凝胶电泳
1、 制胶：
称取1.2g琼脂糖（跑PCR产物时胶的浓度可大些1.5-1.8g）,加入100ml 0.5X TAE，加热融化后冷却至60OC左右，加入5ulEB，混匀。倒入胶板，除去气泡。冷却30min。硬化后放入电泳槽。（用不完可用保鲜膜包好放入4OC保存）。电泳槽内加电泳缓冲液0.5X TAE，使液面高出凝胶表面1-2mm。 2、 上样：
取5ul样品与上样缓冲液按4：1混匀，用微量加样器小心加入凝胶样品孔内，注意勿溢出孔外。 3、 电泳、紫外光检测和分析
接通电源，电压为5v/cm。电泳完成后，切断电源，紫外灯下观察条带。
质粒转化（操作过程需严格在无菌罩内操作）
1XTSS两步转化法
1、 菌种的复苏：用无菌铂丝直接挑取冻存的大肠杆菌菌株，在
LB琼脂平板表面划线，（同时在ALB固体培养基划板，验证大肠杆菌，正常不生长）置37oC培养12-16小时。
2、 从培养板中挑取单个菌落转到3ml LB液体培养基中，于37oC
摇床震摇,培养过夜直到OD值约0.6再转入含有10mlLB（按比例1：100接）液体培养基的烧瓶中剧烈震摇4h,200rpm/min。 3、 取1ml细菌培养物转移到EP管中，冰上静置10min,离心
3500rpmX5min,弃上清。（注意分组） 4、 加入100ulTSS溶液，反复轻柔吹打以重悬菌液（打开细胞壁）。 5、 加入连接产物1ul(体积不能超过10ul)，轻轻混匀后水浴40min。 6、 42oC热休克90s。
7、 冰浴2min，以冷却细胞。
8、 于EP管中加入100ul 37℃预热的LB培养液，37oC震摇30min。 9、 将100ul菌液均匀涂在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上。
37oC培养12-16h。[若所转化质粒可用a-互补筛选重组阳性克隆，则加入80ul/40ul X-Gal(20mg/ml)和8ul/4ul IPTG(20mg/ml),混匀后涂板。
10、 将平板置4oC数小时后，观察培养结果（若非蓝白斑选择质粒
无需此步）。 实验设计
1、 转化时设对照组（不转染任何质粒）和转化组（转化目的质粒） 2、 第9步时，对照组分别在LB固体培养基和ALB固体培养基上
涂板，转化组只需用ALB固体培养基
3、 预期结果：对照组在LB固体培养基生长旺盛，在ALB固体
培养基上不生长；转化组在ALB固体培养基生长。
质粒DNA的分离与纯化
碱裂解法小量提取质粒
[材料]
LB液体培养基
STE溶液（0.1M NaCl，10mM Tris-HCl PH8.0，1mM EDTA）
Solution I溶液（50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl PH8.0，10mM EDTA） SolutionⅡ溶液（0.2M NaOH，1%SDS，现用现配）
SolutionⅢ溶液（5M乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，H2O 28.5ml） 3M乙酸钠溶液pH 5.2、纯水、无水乙醇、70%乙醇 苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）、TE缓冲液（10mM Tris-HCl pH 7.5，1mM EDTA） [方法]
1、挑取含质粒的宿主菌单个菌落接种于5ml ALB液体培养基，37℃振荡培
养20小时以上，至OD600约为0.5。 2、将1.5~3ml菌液转入EP管中，12000rpm离心2分钟沉淀菌斑，弃上清，
倒置于吸水纸上是液体流尽。
3、加入预放置于4℃的STE溶液100ul重悬菌斑，12000rpm离心1分钟，
弃上清，倒置于吸水纸上是液体流尽。 4、加入4℃的100ul的Sol I重悬菌斑，必要时可振荡重悬，4℃放置5~10
分钟。 5、加入200ul新鲜配制的SolⅡ，倒置混匀5~10次，冰上放置2~3min（勿
振），使细菌裂解。 6、加入150ul预置4℃的SolⅢ，温和颠倒数次混匀5sec，冰上放置5min，
使质粒DNA复性。然后15000rpm离心10分钟，上清入新EP管，勿吸沉淀。
7、加入等体积（约450ul）的苯酚/氯仿/异戊醇振荡混匀，15000rpm离心
5min，将上层水相入新EP管，再加等体积的氯仿，振荡混匀，15000rpm离心5min，将上层水相入新EP管。
8、上清入新管，加入二倍体积的预置于－20℃的无水乙醇，再加入原液
1/10体积的3M NaAc，颠倒混匀，－20℃放置1小时，以沉淀质粒DNA。 9、15000rpm离心10min，将上清去掉，再加入1ml 70%的乙醇，沿管壁加
入，8000rpm离心10min，小心将上清弃去。
10、在空气中完全干燥后加入纯水或TE缓冲液30ul溶解沉淀，37℃水浴
30min后放置－20℃保存备用。
质粒提取试剂的配制
SolutionⅠ：50mmol/L 葡萄糖；25mmol/L Tris-HCL（pH8.0）；10mmol/L EDTA
配制方法：
200mmol/L 葡萄糖 25ml （葡萄糖 0.99085g）
0.5 mmol/L EDTA（pH8.0） 2ml 1mmol/L Tris-HCL（pH8.0） 2.5ml
加ddH2O定容至100ml, 高压蒸汽灭菌15min, 贮存于4℃。 Solution Ⅱ：200mmol/L NaOH；1% SDS（现用现配）
配制方法：
5mmol/L NaOH 40ul 10% SDS 100ul ddH2O 860ul
Solution Ⅲ：5mol/L乙酸钾 60ml；冰乙酸11.5ml；ddH2O 28.5ml；PH4.8
配制方法：
乙酸钾 29.442g 冰乙酸 11.5ml
加ddH2O定容至100ml，贮存于4℃。 STE缓冲液:10mmol/L Tris-HCL（pH8.0）； 0.1mol/L NaCL；10mmol/L EDTA （pH8.0）
配制方法：
NaCL 0.5844g
1mmol/L Tris-HCL（pH8.0） 1ml 0.5 mmol/L EDTA（pH8.0） 0.2ml
加ddH2O定容至100ml, 高压蒸汽灭菌15min, 贮存于4℃。
10% SDS（十二烷基磺酸钠） SDS 10g ddH2O 80ml
加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值为7.2，加ddH2O定容至100ml。 (注：SDS为表面活性剂，称量时要戴面罩。10% SDS无须灭菌。) 1mmol/L Tris-HCL（pH8.0） Tris 碱 12.114g 浓盐酸 5.03ml ddH2O 80ml
用浓盐酸调节溶液的pH值为8.0，补ddH2O定容至100ml。 0.5 mmol/L EDTA（pH8.0） EDTA- Na 18.61g ddH2O 80ml 在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值为8.0（约需2gNaOH）ddH2O 定容至100ml，高压灭菌备用。
(注：EDTA二钠盐需加NaOH将pH至调至接近8.0时才能完全溶解。) 3mol/L 乙酸钠（pH5.2）
冰乙酸钠 40.81g ddH2O 80ml
用冰乙酸调节pH至5.2，ddH2O定容至100ml，高压灭菌备用。