QIAGEN质粒大提
提取前准备：
1. RNase A加入Buffer P1,终浓度100ug/ml,2-8℃保存。 2. 检查Buffer P2中SDS状态（低温析出），必要的话37℃预热。 3. 4℃遇冷Buffer P3。 准备材料:
1. 标准的细菌培养物品（接种环、培养皿、摇床等）。 2. 架子（垂直放置柱子。） 3. 冰
4. 70%酒精 5. 异丙醇
6. 质粒溶解液（TE，PH8.0或Tris.Cl,PH8.5） 7. 1.5-2.0ml离心管 8. 4℃离心机
提取步骤：
A)细菌培养、收获和裂解
1.新鲜培养板中挑取单克隆于2-5ml ALB培养基，37℃，300rpm培养8h。（使用的培养器皿体积需大于四倍的培养基体积）
2.按1/500-1/1000比例接种于ALB培养基，37℃，300rpm培养14-16h。高拷贝质粒：取100-200ul接种于100ml ALB培养基。低拷贝质粒：取250-500ul接种于500ml ALB培养基。（使用的培养器皿体积需大于四倍的培养基体积。培养的细菌密度达到3-4X10~9个/ml，这样得到的菌斑重量为3g/L培养基） 3.将获得的菌液4℃，6000g离心15min。（如果此时你想停止提取，可将菌斑冻于-20℃）
4.加入10ml Buffer P1充分重悬菌斑。（确保使用的容器足够装下裂解液，确保使用前加入RNase A，如果Buffer P1内加入LyseBlue,使用前轻柔晃动瓶身以确保LyseBlue混匀，必须确保菌斑充分混匀）
5.加入10ml Buffer P2，轻柔颠倒4-6次混匀彻底，室温（15-25℃）孵育5min。（不能涡旋混匀，这样会使基因断裂。此时溶液变粘稠。不要使裂解反应过程超过5min。加入Buffer P2后立即扣上盖子，避免空气中的CO2使其酸化。如果Buffer P1内加入LyseBlue，那么加入Buffer P2后细菌悬液变蓝，如果悬液不变蓝或仍可见棕色斑块，则继续混匀直到显色）
6.加入10ml Buffer P3，立刻轻柔颠倒4-6次彻底混匀，冰上孵育20min。（使用预冷的Buffer P3和冰浴可以加快沉降，加入Buffer P3后可见白色絮状沉淀，沉淀中含有基因组DNA，蛋白质，细菌碎片和KDS。裂解液需彻底混匀以确保钾、硫酸盐沉淀。如果混合物依然有粘性，那么继续混匀彻底中和溶液。如果使用LyseBlue，蓝色溶液变清。） B)提取上清
7.以4℃，不低于20000g离心30min，立刻取含有质粒的上清。（离
心前，需再次混匀样品。离心需要在非玻璃器皿中进行，例如聚丙烯。离心后上清液清透。）
8.以4℃，不低于20000g离心15min再次离心，取上清。移取120ul上清作为样品1，用于分析以确定生长和裂解的条件是否合适 C)用QIAGEN-tip连接、清洗和洗提质粒DNA
9.向QIAGEN-tip 500中加入10mlBuffer QBT平衡柱子，通过重力使其自然流空。（QIAGEN-tip需要彻底流干，此过程不需要看守，当液面达到柱子上部时自然会停止。）
10.将从第8步获取的上清移入柱子，使其自然流下通过滤膜。（上清应该立刻移入柱子。如果时间停滞过长或者因为蛋白的继续沉降使其浑浊，在放入柱子之前需要重新离心。）移取120ul滤液作为样品2.
11.用2X30ml Buffer QC冲洗柱子。（Buffer QC自然通过柱子，第一遍冲洗足以将绝大多数质粒污染物洗脱，但是当提取量大时，第二遍就非常重要。）移取240ul滤液作为样3。 12.用15ml Buffer QF洗脱DNA。（用15ml或50ml离心管收集洗脱液。不推荐使用聚碳酸酯离心管，因为不能耐受后续步骤使用的酒精。注：如果产物大于45-50Kb，65℃预热洗脱Buffer有助于提高产量。） 移取120ul滤液作为样品4，用于分析。 D)沉淀、清洗、溶解DNA
13.加入10.5ml（0.7倍体积）室温异丙醇到洗脱液中沉淀DNA。立刻混匀，4℃，不低于15000g离心30min。小心弃上清。（一次性锥形底离心管可以选择4℃，5000g离心60min。异丙醇沉淀具有玻璃外观，比酒精沉淀的絮状含盐沉淀难发现。异丙醇沉淀贴壁不牢，弃上清时要非常小心。）
14.加入5ml室温70%酒精，不低于15000g离心10min。小心弃上清避免碰到沉淀。（一次性锥形底离心管可以选择4℃，5000g离心60min。70%酒精用来洗脱沉淀的盐，并且挥发的乙醇可以移走残余的异丙醇，是DNA提取更容易。）
15.空气中干燥沉淀5-10min,用合适体积的质粒溶解液（TE，PH8.0或Tris.Cl,PH8.5）溶解DNA。（溶解DNA时清洗侧壁，充分收集，特别是使用玻璃器皿时。应避免使用移液器反复吹打促进DNA混匀，这可能会导致DNA断裂。沉淀过于干燥会导致DNA难以溶解。DNA溶液最好保存在微碱性环境中，酸性Buffer难以溶解DNA。）
质粒小提试剂盒（所有过程在室温下进行）
E.Z.N. ATM Plasmid Mini Kit I
自 备 物品：13000×g转离心机
无菌1.5ml离心管（4个）
实验前准备：将RNaseA加入到SolutionⅠ瓶中，并置于4℃保存。 用无水乙醇稀释DNA Wash Buffer。
使用前检查SolutionII，SolutionIII有无结晶析出，如果有将其
37℃温育，使其溶解。
1、 ①挑取冻存的含有质粒的大肠杆菌接种ALB固体培养基，37℃培养至
长出单菌落。
②挑取含有质粒的大肠杆菌（DH5α、JM109）单克隆，接种于1-5ml
的ALB中，37℃，300rpm活化12-16h 。
2、 取1.5-5ml菌液，10000g，室温离心1min，弃上清。
3、 加入250ul Solution I/RNaseA,吹打或涡旋重悬菌斑（吹打至看不到固体
颗粒）。<充分重悬有利于提高产量>
4、 加入250ul Solution II，轻柔颠倒混匀数次，清洗裂解产物<禁用振荡器，
用力过猛会导致染色体DNA断裂，Solution II盖子要拧紧>，可室温静置2min（管中拉丝，水膜形成）。
5、 加入350ul Solution III，轻柔颠倒混匀数次，直至白色絮状沉淀生成。
<加入Solution III后立即混匀，必须完全混匀 > 6、 13000×g，室温离心10min。（迅速进行下一步） （柱子使用前加100-200ul Buffer GPS，室温10000g 离心2min,去除GPS） 7、 将上层清夜小心加入干净的 HiBind Miniprep Column(1){将HiBind
Miniprep Column(1)套入2ml收集管}注意不要混入沉淀，确保没有细菌通过柱子。10000g室温离心1min,使液体完全通过柱子。 8、 弃滤液，重新使用离心管。<将滤液暂存于另一离心管>向柱子中加500ul
Buffer HB，10000×g，室温离心1min，弃滤液，重新使用离心管。 9、 向柱子中加入700ul无水乙醇稀释的DNA Wash Buffer，10000×g，室温
离心1min，弃滤液，重新使用离心管。
10、 向柱子中加入700ul无水乙醇稀释的DNA Wash Buffer，10000×g，室
温离心1min，弃滤液，重新使用离心管。
11、 13000×g，室温离心2min，离心空柱子以除去柱子内的酒精。
12、 将柱子放入干净的1.5ml离心管，加入30-50ul Elution Buffer(10Mm
Tris-HCl,PH8.5)或高压过的双蒸水到柱子上，室温静置1-2min, 13000×g，室温离心1min，洗涤DNA，将所得DNA分装入EP管，-20℃保存。（可以进行第二次离心，将残余的质粒洗脱，但是浓度很低）
13、 用琼脂糖凝胶电泳测提取质粒大小，用紫外分光光度计检测质粒浓度。 14、 DNA浓度=A260 X 50 ug/ml
Western blot的原理、操作及注意事项
原理：
通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。 一、抗原的选择和制备 A：样品的制备 1 组织：
组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。 2 细胞：
细胞的处理方法： 离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。 3 分泌蛋白的提取（特例）：
直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。 B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因 1.双缩脲法：
双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。 2.Lowry法：
此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即Cu++与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L～400mg/L含量的蛋白质溶液。其干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上述提到的还原反应只有在pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络合物所还原。 3.紫外吸收法：
大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白质溶液。部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须作适当校正，一般按下述公式粗略计算：
是蛋白质溶液在280nm波长处（光程1厘米）测得的光密度值。是蛋白质
溶液在260nm小波长处（光程1厘米）处所测得的光密度值。
此方程是从烯醇酶（在酵母核酸存在时）得出来的。因此，对其他蛋白质和其他核酸不一定适用。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量不同，因此，浓度为0.1%的各种蛋白质在280nm
处的消光系数（）在0.5～2.5之间变化。
所有的蛋白质在230nm以下都有强吸收。例如，牛血清白蛋白的α0.1%在225nm和215nm处分别为5.0和11.7，而在280nm处测为0.58。在230nm以下的强吸收是由于肽键的存在，因此，此值对所有的蛋白质都是一样的。从215nm和225nm处的光密度之差可用于测定浓度为10μl/ml～100μl/ml的蛋白质。蛋白质浓度可以近似地由下式得到：
光密度之差求 得，这一公式是减去溶液中非蛋白质成分产生的误差。但是，蛋白质之间的分子量差异比较大，因此，在比较几种蛋白质含量时，必须作适当的校正。由于蛋白质的吸收峰常因pH改变而变化，所以在制作标准曲线时，必须与样品条件一致。 4. Bradford比色法：
Bradford比色法比Lowry法测定蛋白浓度更简单迅速。用脱氧胆酸/三氯乙酸沉淀蛋白可排除甘油、去污剂、2-巯基乙醇、乙酸、硫酸铵、Tris和一些碱性缓冲系统的干扰。
分别在两组微量离心管中各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白（5，10，15和20μl），以0.15mmol/l NaCl补足至100μl，同时以两管100μl的0.15mmol/l NaCl作空白对照。每管各加入1ml考马斯亮蓝染料溶液，振荡混匀，室温放置2分钟。用1cm光径的微量比色杯测A595，取A595吸光值对标准蛋白浓度作图，画标准曲线，并测量待测样品的A595。从BSA标准曲线中确定待测样品的浓度。测定10-100μg的蛋白质，要在较大试管中将染料溶液体积增大5倍进行。样品浓度过高，可稀释后进行，或在10-100μg另作一标准曲线进行测定。 5．电泳估算法（我们选择此法）：
样品倍比稀释，SDS-PAGE电泳，同时做定量marker对照，可以估算样品大概浓度。 以提取癌组织总蛋白为例：
① 取等量胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织，用dH2O漂洗5～10次，再用预冷的1×PBS洗涤3次，目的是去除样本中的血液。
② 每2克组织加入3ml 1×PBS匀浆，保持在4℃条件进行。 ③ 加入5×STOP Buffer缓冲液1ml，混匀，4℃下超声碎化。再加入0.5ml β-ME，0.5ml溴酚蓝，煮沸10mins，至此，制样过程完成；
④ SDS-PAGE电泳，以BAS作为对照估计样品蛋白浓度。 二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE） A：实际操作
1. 做胶前的准备
1)检查是否有足够的、干净的 spacer、comb 和架子。 2)检查是否有新鲜的，足量10%APS，没有立刻重配。
3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。
2. 制胶，电泳
1）装好架子。
2)按照下面配方配制分离胶。(单位：ml，Total： 8ml) 2×Sep. buffer 30％ Gel.sol ddH2O TEMED 10%APS
在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好的凝集。
3)待分离胶凝集后，配制浓缩胶。(单位：ml，Total： 3.5ml)
7.5％ 4 2.0 1.9 8ul 80ul 10％ 4 2.7 1.2 8ul 80ul 15% 4 4 0 8ul 80ul