30％ Gel.sol ddH2O TEMED 10%APS 3％ 2×Stacking. buffer 1.7 0.35 1.4 5ul 50ul 倒好后插入预先准备好的梳子。
4)待胶凝集好后，上样，电泳。 上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用100-120V电压。一般电泳时间在1.5小时左右。 B ：注意事项及常遇到的问题
1）分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果。
2
2）上样蛋白量不应超过30ug/mm (载荷面即：如果你的胶槽是5mm×1mm，则载荷面为：1mm×
2
5mm=5mm) 。
3）gel通常在0.5-1h内凝集最好，过快表示TEMED、APS用量过多，此时胶太硬易龟裂，而且电泳时容易烧胶。太慢则说明两种试剂用量不够或者系统实际不纯或实效。
4）混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形。太慢不均匀，特别是甘油。 5）电泳中常出现的一些现象：
︶ 条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。
︵ 条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。
拖尾：样品溶解不好。 纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。 条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。 条带两边扩散：加样量过多。 三、转移
在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上。
膜的选择：印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等。我们选用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。有两种规格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2um for MW<20kDa)。 A 半干法
即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的效果。因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷，但是其转移时间短，效率高。 1 实验条件的选择
电流1mA-2mA/cm2，我们通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间，具体可以根据实际适当调整。 目的蛋白分子大小(kDa) 80---140 25---80 15--40 <20 胶浓度 8% 10 12 15 转移时间(h) 1.5-2.0 1.5 0.75 0.5 2 实验操作
（1）滤纸和膜的准备 (在电泳结束前20分钟应开始准备工作)。
A. 检查是否有足够的transfer buffer，没有立即配制。 B. 检查是否有合适大小的滤纸和膜。
C. 将膜泡入甲醇中，约1-2分钟。再转入transfer buffer中。 D. 将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transfer buffer 中。 （2）转移
A. 在电转移仪上铺好下层滤纸。一般用三层。 B. 将膜铺在靠膜滤纸上，注意和滤纸间不要有气泡，再倒一些transfer buffer到膜上，
保持膜的湿润。
C. 将胶剥出，去掉stack gel，小心的移到膜上。
D. E. F. G. 剪去膜的左上角，在膜上用铅笔标记出胶的位置。
将一张靠胶滤纸覆盖在胶上。 倒上些transfer buffer，再铺两张靠胶滤纸。 装好电转移仪，根据需要选定所需的电流和时间。
转移过程中要随时观察电压的变化，如有异常应及时调整。
靠胶滤纸 胶 膜 靠膜滤纸
3 注意事项及常遇到的问题
1）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>=膜>=胶。 2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。
3）因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润（干膜法除外）。
4）滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤纸换新的。
5）转移时间一般为1.5 小时，( 1mA-2mA/cm2，10% gel)，可根据分子量大小调整转移时间和电流大小。
B 湿法
我们基本上不用此方法，这里暂不做介绍。 C 转移后效果的鉴定 1．染胶
用考马斯亮兰染色经destain脱色后，看胶上是否还有蛋白来反映转移的效果。 2．染膜
有两类染液选择，可逆的和不可逆的。可逆的有ponceau-s red 、Fastgreen FC、CPTS等，这类染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做进一步的分析用。但是不可逆的染料，如考马斯亮兰、india ink、Amido.black 10B等，染色后膜就不能用于进一步的分析。 四、封闭（block）
封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合。
常用的封闭液有bovine serum albumin(BSA)，non-fat milk，casein，gelatin，tween-20等，我们一般用non-fat milk。
在转移结束前配好5%的Milk(TBST溶解)。转移结束后将膜放入milk中block(一定要放在干净的容器里，避免污染而且要足以覆盖膜)，并清洗整理好用过的滤纸，以便下次使用。 Block 4°C O/N，或 RT 1小时。
五、孵育一抗
A. 先将需要检测的抗体准备好，并决定好它们的稀释度。
B. 配好5%的Milk(TBST溶解)，按要求稀释好抗体。注意，如需高比例稀释， 最好采用梯度稀释。
C. 将稀释好的抗体和膜一起孵育。 一般采用RT 1小时，可根据抗体量和膜上 抗原量适当延长或缩短时间。
注意：为了便于后面分析结果，我们一般会选用已确定分子量大小而且纯度高的抗体作为marker与一抗同时孵育。
六、洗涤
用 TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉。然后5mins *5。
洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅。
七、孵育二抗
孵育 RT1 小时。 一般采用HRP标记的二抗，稀释比例为1:5000。 二抗的稀释比例不能太低，否则容易导致非特异性的结合。
注意二抗的选择有多种，要根据一抗来选择抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗，以及根据后面的显色条件来选择HRP、AP或者GOD（葡萄糖氧化酶）酶链的二抗或者标志其他探针（如核素等）的。
八、洗涤
用 TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉。 然后5mins *5。 洗涤是为了洗去二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要干净。
九、显色（HRP酶）
1．增强化学发光法(ECL)
Ecl 显色原理：氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。鲁米诺（luminol，5＇-氨基-2，3-二氢-1，4-酞嗪二酮）的分子结构及化学反应式如下：
鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来。 试验步骤：
1）将两种显色底物1：1等体积混合（一般各1ml/membrane）。 2）将混合物覆盖在膜表面，1-2分钟，摇晃使均匀。 3）用保鲜膜把膜包起来，放入夹板中。
4）在暗室中将X光片，覆盖在膜的上面，夹好夹子，曝光1min。 5）显影、定影。
6）根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果。 注意：荧光在一段时间后会越来越弱。 2.DAB显色
DAB（3,3二氨基联苯胺）和HRP反应产生棕色的不溶终产物。这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想。
对于AP标记的二抗我们选用BCIP and NBT 显色，它们在碱性磷酸酶（AP）作用下反应可生成
一种不溶性黑紫色沉淀的强信号。
十、分析结果及其判断
常见问题原因分析及处理方法： 见附录一、二。
附录一：Troubleshooting Blotting Problems （P43－48）
附录二：Western Blotting Troubleshooting Logic Tree （P390－394）
附录三：试验中所用到的试剂和缓冲溶液
1) 5x Stop Solution (Sample buffer) pH6.7:
Stock: to use:
20% Glycerol 100ml take 9.5ml stock 10% SDS 50g or 250ml 20% SDS add BME 0.5ml
250mM Tris 15.14g bromphenol blue or total 475.00ml pyronine 4 to taste 2) Gel solution (30% w/v acrylamide mix): 0.8 bis-acrylamide 0.8g 29.2% acrylamide 29.2g total 100ml
3) 2x Laemmli Separation Buffer:
0.75M Tris-HCl 90.825g
0.2% SDS 10ml 20% SDS total 1000ml pH8.8
4) 2x Laemmli Stacking Buffer:
0.25M Tris 15.14g 0.2% SDS 1g total 500ml pH6.8
5) 10x Laemmli Running Buffer:
250mM Tris 60.55g 1.9M Glycine 285.27g 1% SDS 20g total 2 liters pH8.3
6) Transfer Buffer:
48mM Tris base 5.81g 39mM Glycine 2.93g 0.037% SDS 0.375g 20% MeOH 200ml total 1000ml 7) TBST:
10mM Tris-HCl， 1.21g 100mM NaCl 0.2% Tween-20 Total 1000ml pH7.4
8) Coomassie Stain :
40%MeOH 400ml 10%HAc 100ml
0.1?R 1g Brilliant Blue R total 1000ml 9) Destain:
30%MeOH 300ml 7.5%HAc 75ml total 1000ml 10) 10×丽春红染液配方： 丽春红 2g 磺基水杨酸 30g 三氯醋酸 30g
total 100ml 11）DAB
DAB 50mg 0.05mol/L TB （PH7.6） 100ml 30%H2O2 30-40ul
先配成2-5倍的储存液，过滤后分装，-20℃避光保存，H2O2在工作液中终浓度0.01％。