释至100ml。
2.2 检测方法及原理简介
食品中碳水化合物的测定方法很多，单糖和低聚糖的测定采用的方法有物理法、化学法、色谱法和酶法等。物理法包括相对密度法、折光法和旋光法等。这些方法比较简单、对一些特定的样品，或生产过程中进行监控，采用物理法较为方便，而化学法是一种广泛采用的常规分析法，它包括还原糖法(斐林氏法、高锰酸钾法、铁氰酸钾法等)、碘量法、缩合反应法等。化学法测得的多为糖的总量，不能确定糖的种类及每种糖的含量。利用色谱法可以对样品中的各种类进糖行分离定量。目前利用气相色谱和高效液相色谱分离和定量食品中的各种糖类巳得到广泛应用。近年来发展起来的离子交换色谱具有灵敏度高、选择性好等优点，也已成为一种卓有成效的糖的色谱分析法。
在这一章中将介绍一些目前最常用的检测碳水化合物的方法。有些特定的方法只能用在一些比较具体的产品上，因为不同的产品，其性质和组成也各不相同。现有的方法已经跟不上新的发展趋势；有些可以用更好的方法，它们通常也更为先进。长期使用的传统方法尽管不如新方法能提供更多更精确的信息，但仍可用于质量保障和产品标准化。
碳水化合物分析技术的发展始于采用颜色进行定性测定。还原糖颜色测定法就是把二价铜还原成一价铜（费林试验）的还原糖定量实验，以后又发展了定性纸色谱法、定量纸色谱法、糖的衍生物气相色谱法、定性和定量薄层色谱法、酶法、高效液相色谱法。另外核磁共振法、质谱法、毛细管电泳法、近红外质谱法、抗体法、免疫分析测定法和荧光色谱法也已经推出。上述方法中的一些目前还没有得到广泛应用，并且仍在不断发展完善之中。
2.2.1水化合物测定样品的制备
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由于碳水化合物的溶解度范围很宽，反应过程不易控制，所以样品的制备方法要同时考虑食品原料、配料、待测产品类型及测定的碳水化合物种类。一般包括：烘干、提取、提取液澄清、检测。
1．烘干：对于大多数食品来说，样品制备的第一步是烘干，这也可用于测定水分含量，将已称重的原料(除饮料外的其他含水食品)置于真空烘箱中，在55℃和1毫米汞柱的真空度下烘干。然后，将原料磨碎至粉末状，脂肪可用体积比为95：5的氯仿—甲醇经索氏抽提法萃取。先进行脂肪萃取可使碳水化合物的萃取变得容易和更彻底。
2．提取：食品中的糖类以下列形式存在：糖+蛋白质→糖蛋白、糖+脂肪→糖脂
（1）常用的提取剂有水及乙醇溶液。因此，测定单糖（葡萄糖、果糖），双糖（蔗糖、乳糖、麦芽糖），三糖（棉子糖），四糖（水苏糖）或者其他低聚糖（麦芽糊精）时，干燥去脂后的样品用80%的热乙醇溶液萃取（最终浓度，在碳酸钙中和酸度条件下），分子量更高的低聚糖—低聚麦芽糖和低聚果糖也能萃取出来，分子量较低的碳水化合物在极性溶剂中是可溶的，但食品中的许多组份（水除外）都是以高聚物的形式存在，几乎所有的多糖和蛋白质在80% 的热乙醇中都是不溶的。因此，这种萃取法相当专一，可通过批处理法完成。标准方法是回流1小时，冷却并过滤（不能用中间带萃取套管的索氏抽提装置，因为乙醇水溶液会形成95%的乙醇共沸物），萃取至少进行两次，并进行检查以保证萃取完全。如果食品原料或产品太酸，如低pH的果汁，则在萃取前有必要进行中和以防止蔗糖的水解，通常采用不溶性的碳酸钙。 80%乙醇萃取除了碳水化合物外，还有灰分、色素、有机酸，还可能会含有游离氨基酸和低分子量多肽。
（2）提取液制备的原则：提取液的制备方法要根据样的性状而定，但应遵
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循以下原则：取样量与稀释倍数的确定,要考虑所采用的分析方法的检测范围。一般提取经净化和可能的转化后，每毫升含糖量应在0.5~3.5mg之间。含脂肪的食品，须经脱脂后再用水提取。 如乳酪， 巧克力，蛋黄酱及蛋白杏仁糖等，一般以石油醚处理一次或几次，必要时可以加热。每次处理后，倾去石油醚层（如分层不好，可以进行离心分离），然后用水提取。含大量淀粉和糊精的食品，如粮谷制品，某些蔬菜，调味品，用水提取会使部分淀粉，糊精溶出，影响测定，同时过滤也困难，为此，宜采用乙醇溶液提取。乙醇溶液的浓度应高到足以使淀粉和糊精沉淀，通常用70~75%的乙醇溶液。用乙醇溶液作提取剂时，提取液不用除蛋白质，因为蛋白质不会溶解出来。含酒精和二氧化碳的液体样品，通常蒸发至原体积1/3~1/4，以除去酒精和二氧化碳。但酸性食品，在加热前应预先用氢氧化钠调节样品溶液至中性，以防止低聚糖被部分水解。提取固体样品时，为提高提取效果，有时需加热，加热温度一般控制在。40~50℃，一般不超过80℃，温度过高时右溶性多糖溶出，增加下步澄清工作的负担，用乙 醇做提取剂，加热时应安装回流装置。
（3）提取液的澄清：提取液除含有单糖和低聚糖等可溶性糖类外，还不同程度地含有一些影响测定的杂质，如：色素、蛋白质、可溶性果胶、可溶性淀粉、有机酸、氨基酸、单宁等。提取液带有颜色，或呈现浑浊，影响测定终点的观察；测定过程中可能与被测成分或分析试剂发生化学反应，影响分析结果的准确性；胶态杂质的存在还会给过滤操作带来困难。加入澄清剂沉淀这些干扰物质。常用澄清剂要符合以下要求：能较完全地除去干扰物质 ；不吸附或沉淀被测糖分，也不改变被测糖分的理化性质；过剩的澄清剂应不干扰后面的分析操作，或易于除掉。澄清剂的用量太少，固然达不到澄清的目的，用量太多则会使分析结果产生误差。不同的样液因干扰物质的种类和含量不同，所需加入澄清剂的量也不同。澄清剂的用量必须适当。
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AOAC法推荐在过滤或离心后加入醋酸铅或类似试剂以替代离子交换法处理。乙醇萃取溶液可在减压条件下，于45-50℃下旋转蒸发，残留物用已知体积的水溶解。至于过滤则视具体情况是否有必要而定。有些方法采用疏水柱（Sep-Pak C18, Waters）作为最后的净化方法来去除残余的脂肪、蛋白质或色素。但如果脂肪和脂溶性成分在萃取前都能有效去除，则不必采用此步骤.
2.2.2单糖和低聚糖测定
食品原料和产品都是非常复杂的，各种组份都有可能对单糖和低聚糖的测定造成干扰，
（1）氧化还原滴定法：在反应过程中由于在氧化还原剂的存在，单糖和低聚糖的还原性基团会有较为复杂的副反应存在；
（2）比色法：干扰也可能来自于测定碳水化合物时所用的具有相同吸收波长的化学试剂，也可能来自于可造成光散射的不可溶胶体物质（此时光的散射被误测为吸光度）。糖的醛基和酮基和其他化合物，尤其是蛋白质的氨基反应（非酶褐变，或称为美拉德反应）而产生颜色，并破坏糖类化合物。
（3）即使采用色谱法，如高效液相法分析时，也必须首先去除组份中那些可能会损坏柱子的成分。
2.2.3食品中还原糖的测定：
还原糖含量的测定有多种形式，实验结果易受分析条件的影响，因此，此类实验都应由训练有素的分析人员进行，以便保持实验条件的完全一致。
1．直接滴定法
原理：将一定量的碱性酒石酸铜甲、乙液等量混合，立即生成天蓝色的氢氧化铜沉淀；这种沉淀很快与酒石酸钾反应，生成深蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜络合物。在加热条件下，以次甲基蓝作为指示剂，用样液滴定，样液中的还
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原糖与酒石酸钾钠铜反应，生成红色的氧化亚铜沉淀；这种沉淀与亚铁氰化钾络合成可溶的无色络合物；二价铜全部被还原后，稍过量的还原糖把次甲基蓝还原，溶液由兰色变为无色，即为滴定终点；根据样液消耗量可计算出还原糖含量。适用范围及特点：本法又称快速法，是国家标准方法，其特点是试剂用量少，操作和计算都比较简便、快速，滴定终点明显。适用于各类食品中还有还原糖的测定。但测定酱油、深色果汁等样品时，因色素干扰，滴定终点常常模糊不清，影响准确性。
测定方法：
（1）样品处理：取适量样品，对样品进行提取，提取液移入250ml容量瓶中，慢慢加入5ml乙酸锌溶液和5ml亚铁氰化钾溶液，加水至刻度，摇匀后静置30分钟。用干燥滤纸过滤，弃初滤液，收集滤液备用。
（2）碱性酒石酸铜溶液的标定：准确吸取碱性酒石酸铜甲液和乙液各5ml,置于250ml锥形瓶中,加水10ml,加玻璃珠3粒。从滴定管滴加约9ml葡萄糖（0.1%）标准溶液,加热使其在2分钟内沸腾,准确沸腾30秒钟,趁热以每2秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液,直至溶液蓝色刚好褪去为终点。
记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。平行操作3次，取平均值。从上述反应式可知，1mol葡萄糖可以将6mol Cu2＋还原为Cu＋。实际上两者之间的反应并非那么简单。实验结果表明，1mol葡萄糖只能还原5mol多点的Cu2＋，且随反应条件而变化。因此，不能根据上述反应式直接计算出还原糖含量，而是用已知浓度的葡萄糖标准溶液标定的方法。在测定过程中要严格遵守标定或时所规定的操作条件，如热源强度（电炉功率）、锥形瓶规格、加热时间、滴定速度等。
（3）样品溶液预测：吸取碱性酒石酸铜甲液及乙液各5.00ml,置于250ml锥形瓶中,加水10ml,加玻璃珠3粒,加热使其在2分钟内至沸,准确沸腾30秒钟,
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