同济大学 硕士学位论文 APP(swe)/PSEN1dE9和Tg6799老年痴呆症转基因小鼠模型系统性比较研究
1) Tg2576小鼠是根据家族性老年痴呆症（Family Alzheimer’s disease，FAD）的发病原因将双突变的hAPP695（Swedish突变K670N/M671L）基因转入小鼠体内，繁育出带有hAPP(swe)的转基因AD小鼠模型。Tg2576小鼠具有如下特征：6月龄脑中出现Aβ，9-11月龄时在小鼠的额叶、海马等部位出现大量的Aβ沉淀[29]。伴随着年龄的增长9月龄Tg2576小鼠在Y迷宫、T迷宫和水迷宫行为学实验中都观察到小鼠学习和记忆功能异常[29-30]。该转基因小鼠由于发病时间较晚，对老年痴呆症的治疗药物筛选来说不是一个很好的动物模型。
2) APP23小鼠过表达带有K670N/M671L双突变的人类APP751基因，该小鼠在6月龄脑内就会出现Aβ沉淀。随后会在血管中出现Aβ沉淀，这种小鼠的淀粉样斑块比较小，随着小鼠的衰老，斑块沉积会迅速增加。其与带有人类PSEN1的转基因小鼠杂交，下一代会表现出更加严重的老年痴呆症状[31]。行为学上18月龄的APP23小鼠与其WT相比，避暗测试和水迷宫上面都表现出差异[32]。
3) PDAPP转基因小鼠是将人类突变的APP(P717F)基因转入到小鼠体内，DPAPP小鼠脑内能够检测到三种形式的APP蛋白，分别为APP695、APP751和APP770。相同月龄的转基因小鼠表达APP蛋白的量为正常小鼠APP表达量的10倍；脑内Aβ40和Aβ42的量为正常小鼠Aβ量的5-14倍，6-9月龄在海马、额叶和胼胝体出现Aβ的沉淀[33]。6月龄PDAPP小鼠与同背景，同年龄的正常小鼠相比，在开放场实验、水迷宫以及辐射状迷宫中表现出严重的记忆障碍[34-35]。
4) APP(swe)/PSEN1dE9转基因小鼠是将突变的人的PSEN1和人的APP转入小鼠体内，是迄今最为常用的AD转基因小鼠之一。在6月龄的小鼠偶尔会出现Aβ沉淀，在9月龄脑中将会有大量的Aβ沉淀产生[36]。9月龄AD和WT小鼠嗅觉和视觉空间记忆等行为学上表现出显著性差异[37]，随着月龄的增加，在水迷宫实验中小鼠找到平台的时间会越来越长，总体的学习记忆能力越来越差[38]。
5) Tg6799小鼠是Holly等人将APP（K670N/M671L、I716V、V717I）和PSEN1（M146L、L286V）的突变基因导入到小鼠体内，K670N/M671L的突变能够增加总的Aβ量，I716V 、V717I和PSEN1的M146L、L286V的突变能增加Aβ42的量。研究发现Tg6799小鼠在一个半月龄脑中就会有Aβ的产生，随着时间增加，脑中的会出现大量Aβ沉淀。同时Aβ42量要远远比Aβ40多。Tg6799小鼠在4-5月龄在Y迷宫的行为学实验中就表现出记忆缺陷[39]。然而，使用该小鼠模型进行AD研究的报道仍很有限，尚无研究系统性对该小鼠模型与常用的APP(swe)/PSEN1dE9小鼠在病理及行为学改变等方面的差异进行比较。
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第1章 引言
表1.1 常用APP和PSEN1转基因AD小鼠类型
小鼠品系 Tg2576 转基因类型 hAPP695（K670N/M671L） 病理改变 6月出现A?沉淀，9-11月龄出现明显A?沉积。 行为学表现 9月龄表现Y迷宫、T迷宫和水迷宫行为学异常。 APP23 hAPP751 （K670N/M671L） APP(swe)/ PSEN1dE9 APP（K595N/M596L） 和第9位外显子被敲除的PSEN1基因 Tg6799 (5XFAD) APP（K670N/M671L、I716V、V717I）和PSEN1（M146L、L286V） PDAPP APP（P717F） 在6-9月在海马、额叶和胼胝体出现Aβ的沉淀 6月龄，在开放场实验、水迷宫、辐射状迷宫中表现出记忆障碍 6月龄出现A?，A?面积较小 6月龄的偶尔会出现Aβ沉淀，9月龄大量产生的Aβ沉淀 18月龄表现出避暗测试和水迷宫出现差异 9月龄在嗅觉、视觉和空间记忆的行为学上表现差异 1.5月龄脑中出现Aβ沉淀，4-5月龄在Y迷宫中Aβ42量要远远多于Aβ40多 表现出差异 1.4.2 转载脂蛋白E(Apo E)转基因小鼠
Apo E基因位于19号染色体上，具有多态性，有2、3、4三种等位基因，分别编码Apo E2、Apo E3、Apo E4，其中以Apo E3最为常见，占78%。有报道显示Apo E4与AD相关，能够促进Aβ的形成，减少Aβ的清除。Apo E4不与Tau结合，但能使Tau蛋白的磷酸化水平增加，干扰微管的装配和完整性从而导致NFT[40]。它对携带APP突变的FAD发病具有促进作用，但对于携带PSEN1突变的FAD没有作用。利用Apo E4敲除的小鼠与PDAPP小鼠杂交的后代表现出Aβ沉积显著减少[41]。
1.4.3 Tau蛋白沉积转基因小鼠模型
Tau是一种促进轴突微管装配和稳定的神经元磷蛋白，另外它还与信号传导、细胞骨架肌动蛋白的组成、细胞内囊泡的运输等有关。该蛋白高度磷酸化则丧失
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与微管的结合能力[42]。有研究者运用hThy1启动子来表达人脑4R-Tau同功型蛋白[43]。尽管病理学缺乏NFT的变化，但该转基因小鼠仍可出现Tau过度磷酸化等一些AD脑中的病理改变，这些都代表着前期阶段NFT的表型。T44Tg小鼠是一种基于Tau突变的动物模型，这种小鼠脑内由于Tau蛋白过度磷酸化而形成NFT，并在4.5月龄水迷宫等行为学实验中表现出行为认知障碍[44-45]。
1.5 老年痴呆症小鼠模型的行为学检测方法
如何判断转基因小鼠是否患有老年痴呆症？如果判断治疗老年痴呆小鼠的药物是否有效？这一系列问题都需要用一定科学的方法去判定。早在1984年Richard Morris创立了一种方法用于检测小鼠的学习和记忆能力。这种方法就是我们现在所熟知的水迷宫[46]。随着科学的不断发展，人们不断的创新，1988年，Ennaceur等人[47]发明了新的方法去检测小鼠的学习能力，这就是新物体识别实验。该实验条件设置对实验动物没有任何伤害，实验动物在相对安静和放松的环境中进行行为学测试。在1997年，Nagahara & Handa用T迷宫来检测动物的学习记忆能力[48]。随着人们对实验条件的要求不同和实验方法的改进，越来越多行为学实验方法被运用到AD研究中，如Barnes迷宫、条件恐惧实验等等。动物行为学实验结果是老年痴呆症的治疗药物疗效评价的重要指标之一。
1.5.1 水迷宫实验
水迷宫实验是由Morris提出的用于检测啮齿类动物的空间学习记忆能力的实验方法。实验将小鼠放入放满水的圆筒里，水面下1.5-2.0 cm处隐藏了一个救生小平台。利用啮齿动物天生怕水的习性，通过训练可让小鼠找到圆筒中的逃生平台。随着训练次数的增加，小鼠逃生找到平台所用时间(潜伏期)将会越来越短。因而潜伏期可作为一个重要的指标来评价小鼠的学习和记忆能力。随着训练的次数增加，正常小鼠找到平台的时间迅速缩短，而在老年痴呆症小鼠中，参与空间记忆和学习的海马区有着不同层次的损伤，所以学习和记忆能力受到影响，因此其水迷宫表现与正常小鼠之间有明显差别。在AD的研究中，水迷宫实验作为一个经典的行为学实验方法对研究有着重要的作用，可以作为治疗AD药物的药效评价的重要指标之一。图1.4为水迷宫示意图。
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第1章 引言
CCD摄像机 采集卡 计算机 水面 圆桶
平台 图1.4 水迷宫示意图[49]
1.5.2 Barnes迷宫实验
Barnes迷宫是通过强光或噪音来刺激动物，驱使动物利用所提供的视觉参考物来找到能够躲避刺激的场所。Barnes迷宫的构造是由一个圆形平台构成，在平台的边缘布满了很多穿透平台的圆形小洞。在其中一个洞的底部放置一个作为实验动物躲避场所的暗盒，其它洞的底部是空的，试验动物无法躲入其中。实验过程中一般采用强光、噪声以及风吹等刺激作为促使实验动物去寻找逃避这些刺激的场所。实验设备的周边会放置一些物体作为实验动物逃避刺激过程中的参考物。实验时把实验动物放置在高台的中央，记录实验动物找到正确洞口所需的时间，以及进入错误洞口的次数，以反映动物的参考空间记忆能力。
1.5.3 条件性恐惧测试
条件性恐惧实验是将小鼠放在一个空间内，通过声音和电击的刺激方式来考察小鼠的记忆能力。实验过程是先给小鼠一定的噪音，间隔一定时间后给小鼠电击，每天反复几次让小鼠建立起声音和电击之间的关联[50]，在测试阶段先给小鼠噪音，然后观察小鼠听到噪音后的反应。这个实验是通过强的刺激来训练小鼠的记忆能力，有记忆能力缺陷的小鼠将会和正常老鼠区分开来。
1.5.4 新物体识别实验
新物体识别实验是一种新的分析大鼠认知和记忆能力的方法，实验过程中利
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用大鼠对新物体好奇的天性，通过新旧物体的探索时间的不同来评判大鼠的记忆能力。实验过程分为两个部分，在第一个部分，让大鼠在自由的空间内自由的探索两个相同的物体。间隔一定时间后，把其中一个物体换成新的物体，再让大鼠去探索，统计大鼠在两个新旧不同物体之间的探索时间，由于大鼠天生的对新物体具有好奇心，所以如果大鼠记住了第一部分探索的物体，那么它对第二部分新加入物体的探索时间要长于对旧物体的探索时间[51]。
之后新物体识别实验成功的运用在东莨菪碱或Aβ多肽导致的小鼠痴呆型疾病模型[52-53]，同时在AD转基因小鼠的动物模型中(APP(swe)/PSEN1dE9，TgCRND8和Tg2576小鼠)的运用亦有报道[54-56]。这种实验方法相对水迷宫实验和条件刺激等实验来说对实验动物的刺激性更小、更温和，让实验动物在最为放松的条件下来完成整个实验过程。
1.5.5 T迷宫实验
早在1997年Nagahara & Handa等人用T迷宫去测试动物的学习和记忆能力，在T迷宫实验中采用饥饿或饥渴的方法驱使小鼠寻找食物或水。T迷宫结构分成三个臂，长的是起始臂。实验开始时将小鼠放在起始臂，另外两个臂末端放有食物。训练时随机打开一个臂给小鼠一定时间让其探索并找到食物。测试时打开所有的臂，让小鼠自由，如果小鼠进入先前进入的臂就算一次错误，进入新的臂就算一次正确，并给予食物奖励[57]。整个实验是对小鼠短暂空间记忆的测试。
1.6 老年痴呆症小鼠模型的生化及病理检测指标
AD研究中行为学实验非常重要，它在某种程度上模拟了AD病人的认知障碍，而生化和病理上的指标的变化更为客观的反映疾病的发生发展过程，是AD研究中必不可少的检验指标。生化指标的检测方法有western blot、ELISA等方法检测AD小鼠中枢神经系统及外周血液系统中的A?水平。在病理上可以通过免疫染色方法标记小鼠脑中淀粉样斑块的沉积状态及脑中胶质细胞炎症活化的状态，从而为疾病的进程提供客观评价指标。
1.7 小结及本研究目的
综上所述，在老年痴呆症的研究中，转基因小鼠模型起到了非常关键的作用。
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