同济大学 硕士学位论文 APP(swe)/PSEN1dE9和Tg6799老年痴呆症转基因小鼠模型系统性比较研究
以便更好的适应环境进而减少小鼠对环境的紧张。第四天为学习和测试阶段，在学习阶段，两个相同的物体首先被放在盒子对角线的两个三等分点上，并保持位置对称，小鼠从最近的角，背对物体放入箱子中，使其在箱子中自由探索两个相同物体10 min。小鼠鼻尖在距离2 cm的范围内指向物体或者用鼻尖、前爪触碰物体都视为小鼠在探索物体，蹲坐或站立在物体上不计为探索时间。用秒表统计小鼠分别对两个不同位置的物体的累计探索时间，计算其中一个物体的探索时间占总的探索时间百分比(Location Preference，位置偏好系数 图2.1)来判断小鼠是否具有位置偏好，正常小鼠的位置喜好系数应保持在 50%左右。10 min后，将小鼠放入饲养的笼中保持1 h时间间隔。将箱子中其中一个物体换成一个颜色和形状都不同的新物体，两个物体在箱子中的位置不变。1 h过后，实验小鼠重新回到箱子中探索新旧两个不同的物5 min分别统计小鼠对新旧两个物体的探索时间，在测试阶段的总的探索时间不足3s的小鼠将被舍弃。我们用新物体的探索时间占总的探索时间比例(Recognition Index RI 区分系数)来表示小鼠对新旧物体的区分程度。小鼠天生的对新鲜事物的好奇心，若小鼠的学习记忆能力正常，在箱子中出现新物体时，在好奇心的驱使下，小鼠会表现出对新物体更感兴趣；出现记忆障碍的小鼠，由于记不住之前探索过的物体，当两个不同的物体同时出现时，小鼠对两个物体的累计探索时间相似。因而可以通过小鼠对新旧物体的区分系数判断是否出现记忆能力障碍。如图2.2为新物体识别过程的示意图引自[54]
图2.1新物体识别计算公式
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第2章 材料与方法
图2.2 新物体识别过程示意图
2.2.3 Morris水迷宫
Morris水迷宫是一个经典的用于来测试小鼠空间学习和记忆能力的实验方法[63]，实验设备由圆桶，加热设备，摄像头，电脑等组成。如图2.3所示，在圆桶周边做好标记便于实验者在做实验的时候将小鼠放入桶中的准确位置，桶的直径为120 cm，被等分为四个不同象限Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。图中的黑色圆点象征着小鼠的逃生平台(直径为8.5 cm)，在做实验的过程中逃生平台没于水面下1.5 cm左右。水面上放有白色塑料颗粒将整个水面覆盖，以便隐蔽逃生平台。实验时桶内的水温要保持在20±2 ℃，以避免因温度过高导致小鼠入水出现不游的现象或温度过低小鼠入水后体温下降过大而导致小鼠死亡。在水迷宫房间的墙壁上贴有不同的标识，以便小鼠通过空间标识物来定位逃生平台在水桶中的位置。
实验前将小鼠从饲养室拿到实验房中并编好号码，实验中将小鼠从远离平台的四个点SE、E、N、NW放入水桶中，每天每只小鼠分别从这四个点放入桶中进行四轮训练实验，每天从四个点放入的顺序不同。做实验过程中，每只小鼠给予60 s寻找隐藏水面下的逃生平台，如果在60 s内找到平台的将给予15s时间让小鼠呆在平台上去学习记忆平台的位置，如果60s后小鼠仍然没有找到平台，我们将小鼠置于平台上并给予15s时间学习和记忆平台的位置。实验持续四天，第五天为测试阶段，测试阶段要将逃生平台去除。小鼠从NE的位置放入桶中，并给予60s的时间让小鼠在桶中自由寻找逃生平台，观察记录小鼠游泳的速度、目的象限百分比、五倍平台象限百分比和穿越平台的次数等。
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N NW Ⅲ Ⅰ NE E SE
S
图2.3 水迷宫平面图
W Ⅳ Ⅱ 2.2.4 动物脑组织的处理及病理染色
2.2.4.1 冰冻切片的制作
在水迷宫和新物体识别结束后，将小鼠经10%水合氯醛麻醉，用0.9%生理盐水通过恒流泵对小鼠进行心脏灌流5 min，灌流结束后将小鼠整个大脑取出来，放在生理盐水中，并迅速将大脑切成左右两个半球，左半球放入预冷的4%的多聚甲醛中固定过夜，次日将固定好的左脑半球依次放入10%、20%、30%蔗糖溶液进行梯度脱水，到脑组织块沉到蔗糖溶液瓶底时，将脑袋取出并用组织包埋液将其包入模具中，液氮速冻，立即切片或放置于-80 ℃保存。 2.2.4.2 Thioflavin S染色
Thioflavin S(Ts)染色在1999年H. LeVine发现并用于AD脑中Aβ的染色，方法简单并且染色效果好[64]。其原理是Ts能够插入Aβ沉淀的β折叠的结构当中，当在荧光显微镜的荧光激发条件下能够可视化Aβ沉淀。Ts染料被广泛用于可视化和量化β折叠蛋白聚集体—淀粉样蛋白，是目前用于检测AD小鼠脑中Aβ斑块的主要染色方法[65-66]。从切片保护液中挑取完整额叶皮层切片或海马组织切片(每只小鼠额叶皮层切片和海马组织切片各取6~8片脑片)至1×PB缓冲液中，摇床上洗3次，每次5 min。然后将切片放入0.1%的Ts染料中染色8 min。染色结束将切片转入1×PB溶液中洗5 min，转入70%的乙醇中漂洗5 min，最后
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第2章 材料与方法
将切片移至1×PB溶液进行展开，将切片贴在载玻片上并用盖玻片封片。用荧光显微镜观察并拍照，统计脑片中Aβ的数量及面积大小。
2.2.5 脑组织western blot
Western blot又称蛋白电泳，它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息[67]，小鼠处死后，左脑被用于做病理染色，右半脑被用于做生化实验，被分成额叶皮层和海马组织，分别放入EP管中并加500 ul的事先加入的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA buffer，然后进行超声处理，在125 AM强度下来超声15 s停5 s反复六次。超声后的样品在16000 g条件下离心10 min取上清。通过BCA定蛋白实验来测定上清中蛋白含量，然后将上清分成两部分，一部分用于脑中Aβ的浓度的检测，一部分用于做western blot实验，这部分根据蛋白浓度的测定结果加入相对应的3×SDS将样品蛋白浓度调至相同水平。
2.2.6 脑组织和血清ELISA实验
ELISA即酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay简称)是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。ELISA检测过程首先由抗原(抗体)吸附在固相载体上，然后加入待测抗体(抗原)，再加相应酶标记抗体(抗原)，形成抗原(抗体)—待测抗体(抗原)—酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物[68]。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量，待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。利用这种方法可以大批量而且准确的测量小鼠脑组织和血清中Aβ的含量。脑组织ELISA样品，在实验前通过超高速离心机在100000g的条件下离心，将样品分为上清和沉淀两部分。上清为SDS可溶部分，沉淀部分可以通过加入甲酸（FA）在超声条件下溶解，被称为FA可溶，FA不溶部分通过超高速离心机去除，将处理好的样品通过ELISA试剂测试A?含量或储存在-80 ℃。
在处死小鼠前，通过眼眶取血的方法对每只小鼠取大约1 ml的血量，将取好的血液通过16000g离心后取上清，直接用于ELISA实验或者储存在-80 ℃。
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2.3 数据统计分析
数据均以均数±标准误差(Mean±SEM)表示，采用GraphPad Prism 5.0软件进行数据统计分析，对于Morris水迷宫的数据用Two-way ANOVA分析。其他实验数据借助t检验确定两组数据之间的差异。*p<0.05，两组之间有显著性差异。
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