第1章 引言
选择一个合适的动物模型对实验者来说会带来很多的方便。目前用于研究AD的发病过程和开发治疗AD的药物的转基因AD小鼠模型有很多。APP(swe)/PSEN1dE9是迄今最为常用的AD转基因小鼠之一，然而该小鼠发病病程缓慢，发生明确的病理及行为学认知改变需要至少9个月龄，因而不利于AD的研究，尤其是治疗性药物筛选研究。而近期报道的Tg6799小鼠出现AD病理改变的时间明显提前，有报道在1.5月龄Tg6799小鼠脑中就出现A?沉积，4-5月龄表现出Y迷宫学习认知异常。然而使用该小鼠进行AD发病机理研究及作为AD治疗药物筛选模型的报道有限，对于该小鼠是否与APP(swe)/PSEN1dE9具有类似的病理改变及认知异常，两种小鼠模型的病程发展有何不同，均无明确报道。为了进一步明确Tg6799小鼠是否可用于AD治疗性药物筛选研究，并为AD研究的动物实验方案设计提供依据，我们系统性比较了4、6、9月龄下这两种小鼠的AD病变特点：包括行为学指标、中枢神经系统病理改变及血清中、脑中Aβ的水平，我们的实验结果将为如何选择恰当的AD实验动物模型及其检测指标提供参考。
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同济大学 硕士学位论文 APP(swe)/PSEN1dE9和Tg6799老年痴呆症转基因小鼠模型系统性比较研究
第 2 章 材料与方法
2.1 材料与仪器
2.1.1 实验动物
APP(swe)/PSEN1dE9转基因小鼠模型：C57BL/6背景，表达APP的K595N/M596L的突变体和第9位外显子被敲除的PSEN1基因[58]，购于Jackson Laboratory(储号004462)。APP(swe)/PSEN1dE9转基因雄鼠与B6C3/F1工具雌鼠交配繁殖子代，子代小鼠经基因型鉴定后用于实验。
Tg6799转基因小鼠模型：C57BL/6背景，表达人类APP的K670N/M671L[59]、I716V[60]、V717I[61]和PSEN1 M146L、L286V的突变基因[62]，来源于中科院。Tg6799转基因雄鼠与B6C3/F1工具雌鼠交配繁殖子代，子代小鼠经基因型鉴定后用于实验。
动物饲养于22±2 ℃的环境中，光照周期为12 h:12 h(照起止时间为：9:00-21:00)。水和饲料自由取食。
2.1.2 实验仪器
实验仪器列表 美国 Amersham 日本OLYMPUS biosciences 1×71荧光倒置显EPS301 核酸微镜 电泳仪 美国Thermofisher 英国Biocote HM 525冰冻切stuart涡旋振荡片机 器 苏州艾克林 OEMCIF IVC 独立换气笼具 美国MEDAssociates水迷宫 12
上海吉量隔音箱 美国 BIORAD电泳仪 美国 BIORAD转膜仪 德国 Eppendorf mastercycle PCR仪 上海琪特 BT1-100 恒流泵 德国 eppendorf 舒适型恒温混匀仪 上海华耀 XB100制冰机 上海博迅 YXO-LS-50 立式压力 蒸气灭菌器 上海碧茜 HB-031金属恒温加热器 上海Tanon 3500R凝胶成像系统 江苏海门QILINBEIER TS-8S脱色摇床 上海菲特 TRUE100超纯水仪 上海欧翔科学仪器bioshine显色仪 美国MED Associates Barnes迷宫 第2章 材料与方法
2.1.3 主要试剂及配方
2.1.3.1 主要试剂
AT180 Tau磷酸Mouse 试剂Thioflavin S化抗体anti-GAPDH 购自Sigma公司 ENDOGEN Thermo GFAP大鼠源一抗购自Invitrogen公AT8 Tau磷酸化ELISA试剂盒美司 抗体 ENDOGEN 吉生物 Alexa Fluor? 546 goat anti-rat IgG AT100 Tau磷酸购自invitrogen 公化抗体 Naltrindole 购自 司 ENDOGEN Sigma公司 2.1.3.2 配方
? 鼠尾裂解液 尿素
EDTA-2Na-2H2O Sarkosyl
Tris/HCl（1M PH8.0） NaCl H2O
? 2×PB 缓冲液 KH2PO4 NaOH H2O
? 切片保护液 蔗糖 乙二醇 1×PB
? TBS洗脱液(10×) Tris 氯化钠 水
? 3×SDS （Loading Buffer） 1M Tris PH6.8(已配) SDS
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Donepezil hydrochloride购自苏州卫材 Tubulin Ⅲ anti-goat antibody anti-Brdu rat-antibody Millipore 4 M（240.24 g） 10 mM（3.722 g） 0.5%（5 g） 0.1 M（100 ml） 0.2 M（11.688 g） 定容1 L 27.2 g 6.4 g 定容1 L 300 g 300 ml 定容1 L
242.3 g 180 g
调节PH至7.5加水定容至2 L
10 ml 1.875 ml 称量0.9 g
同济大学 硕士学位论文 APP(swe)/PSEN1dE9和Tg6799老年痴呆症转基因小鼠模型系统性比较研究
β-巯基乙醇b-ME 甘油glycerol 溴酚蓝
? 生理盐水(2×) Nacl 水
? RIPA buffer Tris-HCl NaCl NP-40
Sodium deoxycholate SDS 水 0.6 ml(通风橱中进行) 4.5 ml
取少许，放在65℃水浴锅中溶解
100 ml 1.8 g 100 ml
500 ml 3.028 g 4.383 g 5 ml 2.5 g 0.5 g
加水调至500 ml并将PH调至8.0
2.2 实验方法
2.2.1 APP(swe)/PSEN1dE9和Tg6799小鼠转基因型的鉴定
2.2.1.1 鼠尾基因组DNA的提取
小鼠出生后4周龄左右，剪取大约0.5 cm的鼠尾尖端，每管中加入0.5 ml鼠尾裂解液和5 μl PK酶（20 mg/ml）置于50 ℃恒温金属浴中振荡约两小时至鼠尾完全裂解。然后每管加入700 μl酚氯仿漩涡混匀，于4 ℃离心机中以9000 rpm的转速离心15 min。小心取上清300 μl至新的Ep管中，加入450 μl异丙醇颠倒混匀，直至看到白色絮状沉淀产生，再次于4℃,9000 rpm离心15 min。弃上清，加500 μl 70%乙醇洗涤沉淀DNA，后放入4 ℃离心机中13200 rpm离心5 min。充分弃上清，敞口干燥2 min后加入50 μl ddH2O（无菌水），于50 ℃溶解5 min或4 ℃过夜溶解DNA。
2.2.1.2 APP(swe)/PSEN1dE9和Tg6799小鼠转基因型的鉴定
PCR鉴定APP(swe)/PSEN1dE9基因引物：
oIMR1644: 5’-AAT AGA GAA CGG CAG GAG CA-3’ oIMR1645: 5’-GCC ATG AGG GCA CTA ATC AT-3’ oIMR7338: 5’-CTA GGC CAC AGA ATT GAA AGA TCT-3’ oIMR7339: 5’-GTA GGT GGA AAT TCT AGC ATC ATC C-3’
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第2章 材料与方法
PCR鉴定Tg6799基因引物：
oIMR3610: 5’- AGG ACT GAC CAC TCG ACC AG-3’ oIMR3611: 5’- CGG GGG TCT AGT TCT GCA T-3’ oIMR7338: 5’- CTA GGC CAC AGA ATT GAA AGA TCT-3’ oIMR7339: 5’- GTA GGT GGA AAT TCT AGC ATC ATC C-3’
PCR反应体系：
20 μl 2 μl 1 μl 4 μl 2 μl 0.2 μl 20 μl。
10×PCR缓冲液(含Mg2+) 10 μM引物混合物 50%甘油 DNA模板 Taq酶 加无菌水补足至
PCR反应程序设置： 94 ℃预变性
15 min 30 s 60 s 60 s
94 ℃变性 65 ℃退火 72 ℃延伸
10 mM dNTP 0.4 μl
以上变性，退火，延伸重复40个循环。
最后在72 ℃保持5 min，使产物延伸完整，10 ℃保存。
2.2.2 新物体识别实验
为避免外界环境对小鼠的干扰，让小鼠能在一个自由放松的环境条件下去进 行实验，实验均在隔音箱中进行。在隔音箱内放有25 cm×25 cm×25 cm的有机玻璃无底盒子，并在箱底放有透明的软塑料玻璃纸，方便每次实验结束对箱内环境的清理。箱内放有摄像头，小鼠的行为可以摄像头记录下来。最后通过摄像记录的结果来统计小鼠的行为变化。实验程序包括4步骤：预适应期、适应期、学习训练期和测试期。第一天为预适应期，实验小鼠在实验进行前30 min，从饲养室转移至行为学实验的房间适应环境。实验开始时，将每只小鼠放入空箱子中自由的探索5 min。第二天和第三天为适应期，每只小鼠每天在空箱子中适应20 min，
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