第3章 结果
第3章 结果
3.1老年痴呆症转基因小鼠的鉴定
3.1.1 APP(swe)/PSEN1dE9和Tg6799小鼠基因型鉴定
APP(swe)/PSEN1dE9实验小鼠是APP(swe)/PSEN1dE9转基因雄鼠与B6C3/F1工具雌鼠交配繁殖的子代。通过对子代鼠尾基因组DNA提取，经PCR扩增后，将扩增的PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳10 min，紫外灯下拍照。在1000 bp左右(红色框内)出现条带为阳性条带，对应的小鼠即为APP(swe)/PSEN1dE9 AD转基因小鼠；相应位置没有条带的小鼠为野生型正常小鼠，如图3.1所示。
图3.1 APP(swe)/PSEN1dE9小鼠基因鉴定
Tg6799实验小鼠是Tg6799转基因雄鼠与B6C3/F1工具雌鼠交配繁殖的子代。通过对子代鼠尾基因组DNA提取，经PCR扩增后，将PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳15 min，紫外灯下拍照。在600bp左右(红色框内)出现条带为阳性条带，对应的小鼠即为Tg6799 AD转基因小鼠；相应位置没有条带的为野生型小鼠，如图3.2所示。
图3.2 Tg6799小鼠基因鉴定
21
同济大学 硕士学位论文 APP(swe)/PSEN1dE9和Tg6799老年痴呆症转基因小鼠模型系统性比较研究
3.2 APP(swe)/PSEN1dE9和Tg6799小鼠行为学检测
3.2.1 不同月龄APP(swe)/PSEN1dE9和Tg6799小鼠的水迷宫实验
在老年痴呆症的研究中，动物的行为学实验非常重要，它能够模拟AD病人的学习认知障碍。APP(swe)/PSEN1dE9是迄今最为常用的AD转基因小鼠之一，但发生明确行为学认知改变需要至少9个月龄，有报道显示4月龄Tg6799小鼠在T迷宫和Y迷宫实验中出现学习认知障碍。然而两种小鼠模型的病程发展有何不同，Tg6799小鼠是否与APP(swe)/PSEN1dE9具有类似的认知异常，尚缺乏系统性比较研究。为了更好的了解两种不同小鼠之间的差异，我们对这两种小鼠行为学做了细致的比较。取不同年龄阶段的两种小鼠进行两个经典的行为学实验：水迷宫和新物体识别实验。根据前人报道，Tg6799 AD小鼠在4-5月龄和WT小鼠相比在T迷宫和Y迷宫实验中出现了行为学的差异[39, 69]，为此我们选取4、6、9月龄的两种小鼠去比较水迷宫实验上的不同，实验结果如图3.3所示:
图3.3 APP(swe)/PSEN1dE9和Tg6799小鼠水迷宫实验比较。APP/PS1代表APP(swe)/PSEN1dE9。图A、B和C分别为Tg6799小鼠4、6和9月龄水迷宫潜伏期曲线，图D、E和F分别为APP(swe)/PSEN1dE9小鼠4、6和9月龄水迷宫潜伏期曲线。**p< 0.01，***p< 0.001。
22
第3章 结果
实验结果表明，4月龄Tg6799小鼠与其WT型对照小鼠相比，潜伏期延长，具有显著性差异(Two-way ANOVA，P< 0.01)，而4月龄APP(swe)/PSEN1dE9小鼠与其WT对照小鼠相比，潜伏期没有显著性差异。随着病程的进展，6月龄及9月龄APP(swe)/PSEN1dE9和Tg6799小鼠水迷宫实验潜伏期均长于其WT对照小鼠，具有显著性差异(均为P<0.001)，且Tg6799小鼠与WT小鼠的差异更为明显(表3.1)。由此可见，Tg6799小鼠发病比APP(swe)/PSEN1dE9小鼠略早，Tg6799 更早的出现记忆缺陷，而在疾病进程后期，两种小鼠均出现记忆缺陷，而Tg6799小鼠更为严重。这一差别对治疗性给药实验而言，便于缩短给药时程，同时Tg6799小鼠更为明显的行为认知异常的窗口，更易于观察给药后的疗效。
表3.1 APP(swe)/PSEN1dE9和Tg6799水迷宫潜伏期均值比较
Day 4潜伏期 (AD vs WT) 4月龄 6月龄 9月龄 27.3±2.1s vs 26.4±3.5s 39.1±4.7s vs 23.7±1.9s 43.3±2.9s vs 27.4±2.9s 26.9±5.0s vs 34.8±3.2s 31.3±3.1s vs 24.2±2.8s 54.0±3.0s vs 27.3±5.3s APP(swe)/PSEN1dE9 Tg6799 3.2.2 不同月龄APP(swe)/PSEN1dE9和Tg6799小鼠新物体识别实验
在水迷宫实验中小鼠是被迫性去找逃生平台，对小鼠而言具有一定的伤害和应激。新物体识别实验作为一个新的行为学实验方法，渐渐的被广泛的用于研究有关记忆缺陷的疾病领域[70]。它的优点在于对于研究动物来说无刺激和无强迫的，根据动物天生的本能来考察正常动物和记忆缺陷动物的不同。正常小鼠对新鲜事物具有好奇和探索的行为，人们就利用小鼠这种天性来考察小鼠记忆能力。具有记忆缺陷的小鼠无法分清新旧物体，因而在新物体识别中对新旧物体的探索时间上无明显差异。为此我们选取4、6、9月龄小鼠来比较两种小鼠在新旧物体实验上的不同，实验结果如图3.4所示：
23
同济大学 硕士学位论文 APP(swe)/PSEN1dE9和Tg6799老年痴呆症转基因小鼠模型系统性比较研究
图3.4 APP(swe)/PSEN1dE9和Tg6799小鼠新物体识别实验比较。APP/PS1代表APP(swe)/PSEN1dE9。图A、B和C分别为Tg6799小鼠4、6和9月龄新物体识别实验结果，图D、E和F分别为APP(swe)/PSEN1dE9小鼠4、6和9月龄新物体识别实验结果。*p< 0.05。
两种小鼠在新物体识别实验上表现基本一致。4月龄的两种AD小鼠与其WT 对照小鼠相比，未表现出明显的差异(RI均在60%左右)。而在6月龄和9月龄的两种AD小鼠和其WT 对照小鼠相比，均表现为RI值的明显降低，差异具有显著性(P<0.05)。以上结果显示两种转基因小鼠模型在新物体识别实验中表现类似，如采用新物体识别方法评价AD疾病进程，应选取6月龄以上AD小鼠作为研究对象。
在水迷宫和新物体识别实验中，APP(swe)/PSEN1dE9与Tg6799两种AD转基因小鼠具有类似的学习认知障碍，而Tg6799小鼠症状更为明显，且发病时间更早，因而Tg6799小鼠更为适合用于治疗AD的药物筛选研究。
24
第3章 结果
3.3 APP(swe)/PSEN1dE9和Tg6799老年痴呆症小鼠脑组织生化指标检测
3.3.1 脑中APP含量的测定
APP(swe)/PSEN1dE9和Tg6799小鼠都转有人类突变的APP基因，突变的人类APP基因在转基因小鼠体内过表达APP蛋白。与转基因小鼠相比，WT对照组小鼠体内只表达内源性的APP基因，因而APP蛋白表达量低。通过western blot我们检测了WT和AD小鼠在APP表达量的差异（如图3.5），两种转基因小鼠APP蛋白表达量与其WT相比具有显著性的增加。该实验可用于验证小鼠是否转入了APP基因的，作为对PCR鉴定的补充。
WT AD WT AD WT AD
图3.5 APP(swe)/PSEN1dE9和Tg6799小鼠的APP检测。APP/PS1代表APP(swe)/PSEN1dE9。图A为western blot 结果，图B为western blot 结果统计分析。***p< 0.001。
3.3.2 额叶皮层和海马组织磷酸化Tau的检测
3.3.2.1 AT180抗体检测Tau的磷酸化
水迷宫和新物体实验结束后，取小鼠脑组织样品进行生化指标检测。有报道指出AD发病与Tau磷酸化水平有着密切关系[71-72]，AD病人脑中Tau的磷酸化水平相比正常人有着非常明显的增加，Tau过度磷酸化会导致NFT的形成，从而导致神经退行性改变[73-74]。
25