1 材料与方法
1.1 材料
雄性Wistar大鼠6只，体质量180～200 g，SPF级，由青岛市药物检验所实验动物中心提供。RPMI?1640完全培养基购于中国医学科学院生物医学工程研究所;Ⅳ型胶原酶、2.5 g/L胰酶、锥虫蓝均购于美国Sigma公司;Percoll液购自于北京华美公司;考马斯亮蓝G?250、谷丙转氨酶(ALT)试剂盒、谷草转氨酶(AST)试剂盒均由杭州博日生物技术有限公司提供;125I肿瘤坏死因子?α(TNF?α)放射免疫分析试剂盒、125I白细胞介素1(IL?1)放射免疫分析试剂盒、125I白细胞介素?6(IL?6)放射免疫分析试剂盒均购自北京普尔伟业生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 肝细胞及Kupffer细胞的分离 本文参照SMEDSROD等[5]方法加以改良分离收集肝细胞，利用Percoll液密度梯度离心法收集Kupffer细胞。
1.2.2 肝细胞和Kupffer细胞的培养及观察 单独培养组调整肝细胞密度至1.5×108/L并接种到培养皿，置于含体积分数0.05 CO2孵箱，在37 ℃、100%湿度条件下培养，12 h后更换新鲜培养液。共同培养组将肝细胞按1.5×108/L的细胞密度、Kupffer细胞按2.5×107/L细胞密度(6∶1) 共同接种于培养皿，置于含体积分数0.05 CO2孵箱，在37 ℃、100%湿度条件下培养，12 h后更换新鲜培养液。每培养12 h更换培养液并吸取上清液用全自动生化检测仪检测清蛋白、ALT、AST、IL?1、IL?6、TNF?α，并观察细胞形态及生长情况。
1.2.3 检测指标 采用考马斯亮蓝G?250方法测定清蛋白，采用ELISA法分别检测上清液中ALT、AST、IL?1、IL?6及TNF?α含量。
1.3 统计学处理
采用PPMS 1.5软件[6]进行统计学处理，数据以±s表示，组间比较用两样本均数t检验。
2 结 果
2.1 形态学观察
倒置显微镜下，新分离的大鼠肝细胞晶莹透亮，呈圆球形，折光性强，有立体感。台盼蓝染色计数显示健康肝细胞的比例平均为92%。同时，新分离的Kupffer细胞胞浆透亮，多呈圆球形，少数呈多形性，散在分布，大小不一致，约6 h后，细胞开始伸展，体积增大，48 h后细胞充分展开，呈典型的星形或多边形，边界不清。在单独培养组，肝细胞的生长、增殖较共同培养组的细胞迅速，接种4 h后肝细胞贴壁、伸展，连接成条索状;24 h后绝大多数肝细胞贴壁，呈扁平状，体积明显增大;48 h后肝细胞贴壁牢固，细胞开始增殖，细胞间出现岛状连接，部分肝细胞呈双核;72 h后肝细胞开始增殖，在原来肝细胞周围出现透明且体积较小的上皮样细胞，呈多边形，逐渐铺满培养皿底;10 d后培养液的上清中悬浮细胞逐渐增多，细胞开始大量死亡;至培养15 d时细胞全部死亡。在共同培养组，24 h后绝大多数肝细胞贴壁，呈扁平状，体积增大;肝细胞生长增殖缓慢，于96 h即开始出现少量的死亡细胞漂浮，至培养10 d时细胞基本全部死亡。
2.2 功能测定
共同培养组清蛋白水平在24、36、48、60 h低于于单独培养组(t=2.551～3.139，P<0.05);共同培养组ALT、AST水平在24、36、48、60 h明显高于单独培养组(t=2.446～3.108，P<0.05);培养36 h后，共同培养组上清液中IL?1为(0.17±0.03)μg/L，IL?6为(0.03±0.01)μg/L，TNF?α为(39.73±5.26)pmol/L，而单独培养组未检测到上述细胞因子。见表1～3。
表1 各组大鼠肝细胞上清中清蛋白水平比较(ρ/g·L-1，±s)组 别n24 h36 h48 h60 h单独培养组60.679±0.0450.556±0.0300.535±0.0440.536±0.044共同培养组6 0.548±0.059* 0.472±0.057* 0.468±0.047* 0.477±0.033* 与单独培养组比较,*t=2.551～3.139，P<0.05。
表2 各组大鼠肝细胞上清中ALT水平比较(z/U·L-1，±s)组 别n24 h36 h48 h60 h单独培养组682.40±4.1882.90±2.6080.90±4.1682.80±2.92 共同培养组6 89.90±3.69* 86.90±2.62* 87.20±3.50* 89.80±4.65* 与单独培养组比较,*t=2.666～3.108，P<0.05。