表3 各组大鼠肝细胞上清中AST水平比较(z/U·L-1，±s)组 别n24 h36 h48 h60 h单独培养组6142.20±5.54140.50±6.44150.60±4.42149.50±3.94共同培养组6 151.20±5.57* 148.90±5.33* 160.80±6.78* 155.60±3.24* 与单独培养组比较,*t=2.446～3.090，P<0.05。
3 讨 论
3.1 肝细胞的分离及形态功能观察
肝细胞是肝脏最主要的实质细胞类型，正常生理状况下占60%。肝细胞完成肝脏的绝大部分功能，是肝脏的主要效应细胞，同时也是生物及化学损伤的主要靶点。肝细胞性状的生物学检测，包括形态和功能两方面。研究发现，细胞接种2 h后就开始贴壁，20 h后约有80%的细胞贴壁，细胞贴壁后开始变平变薄，可见双核细胞和多核细胞，部分细胞开始小范围的呈岛状连接;48 h变化更明显，整个细胞变薄并向四周拉平，细胞形成岛状连接成片，可见许多双核细胞和多核细胞;培养1周后可见少量的新生细胞，透亮，胞浆与胞核的区别不很明显;培养2周后，可见大量的新生细胞，也呈岛状生长，极具立体感[7?8]。
3.2 Kupffer细胞在机体防御和肝细胞损伤中的作用
Kupffer细胞寄居于肝血窦内皮细胞之间或之上，是体内固定型巨噬细胞中最大的群体，占巨噬细胞总数的80%～90%，约占肝细胞总数的15%[9]。Kupffer细胞的主要生理功能包括吞噬和清除功能，能吞噬和清除进入肝脏有害于人体的外来抗原、某些有害物质以及分泌前列腺素和氧化类物质，杀灭肿瘤细胞。以往研究发现，牛磺酸和支链氨基酸对四氯化碳所致的肝细胞损伤具有保护功能，其保护作用可能是通过抗脂质过氧化作用实现的[10]。在病理情况下，多种因素致使Kupffer细胞活化，活化后其功能则明显增强，可合成和分泌多种生物活性物质，释放的大量促炎递质如TNF?α、IL?1、IL?6、IL?8、氧自由基、一氧化氮以及花生四烯酸代谢产物等，能够参与机体的炎症反应和免疫反应，导致和加重肝细胞的损伤[11]。Kupffer细胞能够通过表达FasL，与肝细胞表面的Fas直接结合，诱导肝细胞凋亡[12]。Kupffer细胞还能募集中性粒细胞和淋巴细胞进入肝组织，加重肝细胞损伤。鉴于Kupffer细胞在肝脏功能中的重要作用，建立适宜的肝细胞Kupffer细胞体外培养体系，对于进行肝细胞移植、肝细胞功能和药物代谢等的研究有重要意义。本实验Kupffer细胞生长良好，保持IL?1、IL?6、TNF?α等细胞因子分泌功能。
3.3 共同培养体系中 Kupffer细胞对肝细胞影响
共同培养体系即是将两种细胞(可以来自同一组织，亦可以来自不同的组织)混合共同培养，从而使其中一种细胞的形态与功能稳定表达，并维持较长的时间。原代肝细胞培养体系中由于分离过程的影响，总会有一些非实质细胞的污染。在复杂的细胞培养体系中，星形细胞来源的纤维母细胞和其他细胞也可以产生细胞外基质和细胞因子，从而建立起局部区域而支持肝细胞增殖或分化培养。本实验研究结果表明，肝细胞和Kupffer细胞按6∶1的比例同步贴壁共培养，肝细胞在体外的生存时间和活性会受到一定的影响;共同培养组细胞培养基中的ALT、AST释放明显增加，说明Kupffer细胞能诱导肝细胞的损伤。清蛋白由肝脏合成，因此清蛋白浓度可以反映肝脏的功能。以往研究发现，活化的肝内非实质细胞产生TNF?α、IL?6等细胞因子诱导肝细胞清蛋白合成的下降[13]。本研究显示，共同培养组清蛋白水平低于单独培养组，同时共同培养组检测到有IL?1、IL?6、TNF?α产生，而单独培养组未检测到三者，提示Kupffer细胞与肝实质细胞体外共同培养时，通过分泌IL?1、IL?6、TNF?α使肝细胞蛋白合成功能受损。
本实验研究了Kupffer细胞与肝实质细胞体外共同培养时，肝实质细胞生长、形态及功能的损伤情况，但其具体机制目前并不清楚。Kupffer细胞和肝细胞的相互作用及其结果值得深入、全面地研究。