图1 柴胡皂苷a (1)，柴胡皂苷d (2) 和柴胡皂苷c (3)的结构式
2 方法与结果
2.1 方法原理 在一定的线性范围内成分的量(质量或浓度)与检测器响应成正比，即：W=f×A[6]。在多指标质量评价时，以药材中某一典型组分(有对照品供应者)为内标，建立该组分与其他组分之间的相对校正因子，通过校正因子计算其他组分的含量。这种测定一个成分，实现对多个成分定量的方法命名为一测多评法。
假设某样品中含有i个组分，存在Wi/Ai=fi(i=1, 2,…,k,…,m)①。式中Ai为组分i的峰面积;Wi为i组分的量。选取其中一组分k为内标，建立组分k与其他组分m之间的相对校正因子，有fkm=fk/fm=(Wk×Am) /(Wm×Ak)②。由此可导出定量计算公式：Wm=(Wk×Am) /(fkm×Ak)③。式中Ak为内标物峰面积，Wk为内标物量;Am为组分m的峰面积，Wm为组分m的量。
2.2 一测多评方法学考察
2.2.1 色谱条件色谱柱为Venusi ASB-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱(0～50 min, 25→90% A;50～55 min, 90→90% A;55～60 min, 90→25% A;60～70 min, 25→25% A); 流速1.0 ml·min-1;柱温30℃;检测波长210 nm。在上述色谱条件下，SSc，SSa，SSd与其它峰能达到较好的分离。对照品及样品HPLC图谱见图2。
2.2.2 对照品溶液的制备精密称定柴胡皂苷c、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d对照品1.02，2.05，2.39 mg置于同一2 ml量瓶中，用色谱甲醇定容，制得混合对照品溶液，于4℃保存备用。
1.SSc 2.SSa 3.SSd
图2 对照品(A)及样品(B)的HPLC图
2.2.3 供试品溶液的制备取本品粉末(过60目筛)约0.5 g，精密称定，置50 ml三角瓶中，加入5%氨水甲醇溶液25 ml，密闭，于30℃水温超声处理30 min，滤过，滤渣用甲醇润洗两次，每次10 ml，合并滤液，回收甲醇至干。残渣加甲醇(色谱纯)溶解并转移至5 ml量瓶中，过0.45 mm的微孔滤膜，即得。
2.2.4 线性范围精密吸取上述混合对照品溶液2, 5, 10, 15, 20 μl注入高效液相色谱仪，按“2.2.1”项下色谱条件进行分析。分别以对照品量C (μg)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得柴胡皂苷c、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的标准曲线回归方程及线性范围(见表1)，表明各化合物在相应范围内线性关系良好。 表1 线性关系实验结果
2.2.5 校正因子计算以SSa为内标，按“2.1”项下公式②，分别计算SSa对SSc和SSd的校正因子，见表2。表2 SSa 对SSc和SSd的相对校正因子
2.2.6 精密度实验精密吸取同一混合对照品溶液20μl，连续进样6次，记录SSc, SSa和SSd的峰面积，其峰面积的RSD分别为1.40%，1.30%和1.47%。表明仪器精密度良好，符合含量测定要求。
2.2.7 稳定性实验取同一供试品溶液20 μl分别于0，2，4，6，8，10 h进样测定，记录SSc, SSa和SSd峰面积，其峰面积的RSD分别为1.70%, 2.00%和2.10%。表明SSc、SSa和SSd在10 h内稳定不变。
2.2.8 重复性实验称取同一批柴胡药材粉末(60目)约0.50 g共6份,精密称定,按供试品溶液处理方法制备样品并测定, SSc, SSa和SSd含量的RSD(n=6)分别为1.20%, 2.94%和2.87%。表明实验方法重复性较好。
2.2.9 加样回收率精密称取已知含量的柴胡药材粉末(60目)适量 6份，分别加入一定量的SSa对照品，按供试品溶液处理方法制备样品并测定，计算加样回收率，SSa的平均回收率为101.64%, RSD(n=6)为2.33%。表明实验方法准确度符合要求。
2.2.10 样品测定分别精密吸取供试品、混合标准品各20μl注入高效液相色谱仪并测定。分别采用一测多评法和外标法计算柴胡药材中SSc、SSa和SSd含量(见表3)。表3 两种方法测定不同产地柴胡药材中3种皂苷含量
2.3 一测多评方法耐用性和系统适应性评价