1 材料与仪器
1.1 实验动物 NIH小鼠,90只,雌雄皆用,体重20~26 g,6~8周龄,清洁级,由广州中医药大学实验动物中心提供,合格证号2008A015。小鼠在恒温25~28℃,光照正常的环境中进行7 d适应性喂养后,分组进行实验。随机分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组、加味茵陈五苓散高、中、低剂量组。
1.2 药物 加味茵陈五苓散由白背叶根30 g,茵陈30 g,泽泻15 g,茯苓15 g,猪苓15 g,白术15 g,珍珠草20 g,黄花倒水莲15 g组成(即茵陈五苓散原方去桂枝,加白背叶根、黄花倒水莲、珍珠草组成。)以上药材由广州中医药大学第一附属医院中药房提供;低、中、高剂量组药液每毫升含复方生药量分别为1.29 ,2.58,5.16 g;五酯片,广西方略药业有限公司生产,批号Z20025766。
1.3 试剂 冻干卡介苗制剂 (Calmette Guerin bacillus vaccine,BCG)购自中国生物技术集团公司上海生物制品研究所,批号:20070901;脂多糖 (1ipopo-lysaccharide,LPS)为Sigma公司产品,临用前用生理盐水稀释;丙氨酸氨基转移酶 (ALT)测定试剂盒 ,批号:20080506;天冬门氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒,批号:20080506;丙二醛(MDA)测定试剂盒,批号:20080419;超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒,批号:20080418;蛋白测定试剂盒(考马斯亮蓝法)测定试剂盒,批号:20080419;一氧化氮NO测试盒(硝酸还原酶法),批号:20080419均为南京建成生物工程研究所产品;TNF-α试剂盒为晶美公司产品,批号:20080420。
1.4 仪器与设备 TDZ4-WS台式低速离心机,长沙湘仪离心机仪器有限公司产品;Agilent 8453紫外分光光度计,上海分析仪器厂产品;RT-2100酶标分析仪;电热恒温水浴锅:上海医疗器械五厂产品。
2 方法
2.1 小鼠免疫性肝损伤造模及动物分组参照文献[1],并做适当修改。取雄性NIH小鼠90只,体重 20~26 g,随机分为 6组,每组15只,分别为正常对照组,免疫性肝损伤模型组 (简称模型组),加味茵陈五苓散高、中、低剂量组和阳性对照组。模型组与治疗各组小鼠于实验1 d每只尾静脉注射BCG悬液约为2.96×107个活菌0.2ml,从造模之日起治疗组和阳性对照组开始用药:治疗低、中、高剂量组小鼠分别按人体剂量的40,20,10倍灌服25.8,51.6,103.2 g/kg加味茵陈五苓散水煎液,20 ml/kg,阳性对照组按人体剂量的10倍灌服0.46 g/kg五酯片药液,20 ml/kg,正常对照组和模型组分别灌胃等容积的生理盐水。实验的第12天,除空白组以生理盐水0.2 ml/20 g外,其他各组以LPS 7 μg/20 g尾静脉注射。于静脉注射后10 h时,摘取眼球取血1ml,脱臼处死动物,并迅速取出肝脏和脾脏称重,计算脏器系数,以3 000 r/min离心分离血清,取肝脏左叶制备10%组织匀浆,离心后取上清测定各项指标,取肝脏右叶同一部位组织10%甲醛固定,制作石蜡切片,HE染色做常规组织病理。
2.2 检测项目
2.2.1 血清酶活性测定 取分离后的血清0.2 ml,按试剂盒所述方法测定血清中的ALT,AST(赖氏法)。
2.2.2 肝、脾及胸腺脏器系数测定 剖取胸腺、肝脏和脾脏,称重,计算每 10g体重的脏器重量 (胸腺指数、肝指数和脾指数)。
2.2.3 测定组织中的MDA与SOD水平测定 取肝脏约0.5 g,用冰冷生理盐水漂洗,除去血液,滤纸拭干,称重,在冰浴盒上剪碎,用生理盐水配成10%肝组织,使用匀浆器制备肝组织匀浆,低温离心取上清液,按试剂盒说明书所述方法用紫外可见分光光度计测定肝匀浆中SOD,MDA含量。
2.2.4 血清NO及TNF-α含量测定 取血清0.1ml按试剂盒说明书所述方法用测定血清NO含量;另取血清0.1ml按试剂盒说明书所述方法检测TNF-α(ELISA法)。
2.2.5 肝组织病理学观察 取各组小鼠肝右叶同一部位,用10%甲醛固定,石蜡包埋,切片,HE染色,光镜下观察各组肝脏组织病理变化情况。