作者：陈腾祥，夏高晓，陈丽，刘亚伟，刘靖华，姜勇
【摘要】 目的： 表达纯化重组的His-EGFP-CRP蛋白，通过毛细管电泳技术对该重组蛋白的生物活性进行评价。方法: 用pET14b/EGFP-hCRP原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达，表达的重组蛋白通过亲和色谱纯化、梯度透析，获得复性的His-EGFP-CRP蛋白；并用高效毛细管电泳（HPCE）技术对复性的蛋白进行检测，了解蛋白质的等电点及活性。结果: 转化实验发现，该质粒pET14b/EGFP-hCRP在BL21（DE3）中能够被诱导表达；通过包涵体变性溶解、亲和色谱纯化可获得纯度较高的His-EGFP-CRP蛋白；HPCE分离发现复性后的His-EGFP-CRP蛋白峰为多个，其在电泳液pH值低于6时易检出，His-EGFP-CRP与THP-1细胞裂解物孵育后的检测峰增多。结论: 成功地在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达重组蛋白His-EGFP-CRP，通过包涵体变性溶解及亲和色谱纯化获得该重组蛋白，复性后的His-EGFP-CRP等电点接近于6，以单体或多聚体等结构形式存在，具有结合活性，能与细胞内相关分子结合成复合物，可应用于CRP功能和内化机制的研究。
【关键词】 C反应蛋白； 基因表达； 蛋白质复性； 电泳，毛细管
［Abstract］ Objective: To express the purified recombinant protein, His-EGFP-CRP, and to evaluate the feasibility of its application in the research of function and internalization mechanism of human C-reactive protein （CRP）. Methods: The re-constructed vector pET14b/EGFP-hCRP was transformed into Escherichia.coli BL21（DE3）, induced by isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside （IPTG）. The expressed protein, His-EGFP-CRP, was purified with affinity chromatography method and refolded with gradient filtration. The renatured His-EGFP-CRP was analyzed with high performance capillary electrophoresis （HPCE） to evaluate its isoelectric point （pI） and bio-activity. Results: Fusion protein His-EGFP-CRP successfully expressed in transformed E. coli cells after the induction, and then was purified with inclusion lysis and affinity chromatography. His-EGFP-CRP was detected at several peaks of the fraction profile of HPCE when the pH of electrophoresis buffer was under 6. The number of His-EGFP-CRP detection peaks increased after the protein was incubated with lysate of THP-1 cells. Conclusions: The pI of His-EGFP-CRP is about 6, and its structures may be monomer or polymer, which have the ability to bind relative molecles in lysate of THP-1 to form complex. These results suggest the recombinant protein could be used in exploiting the function and internalization mechanism of human CRP.
［Key words］ C-reactive protein; gene expression; protein renaturation; electrophoresis,capillary
C-反应蛋白（C-reactive protein, CRP）是一种发现较早的蛋白质，在急性心肌梗塞、创伤、感染、炎症、外科手术和肿瘤侵润时，其血浆浓度急剧升高，达到正常水平的数百倍，乃至数千倍，可以作为上述疾病的临床监测指标，是急性期蛋白的主要成员之一［1］。CRP在免疫反应过程中能识别病原体和宿主受损细胞，介导补体系统和吞噬细胞将它们清除，发挥免疫调理功能［2］。除此之外，近些年来研究表明CRP的功能十分复杂，发现其能通过胞膜进入培养的主动脉内皮细胞，从而参与粥样动脉硬化症等心血管疾病的发生［3～5］。然而，对于CRP内化进入细胞的行为和机制还缺乏深入的研究，原因之一是纯化原核表达的CRP有较大难度，不易获得有体外活性的重组表达物。为解决这一技术难题，构建了带his纯化标签和EGFP荧光标记的人CRP原核表达质粒［4］。在此工作基础上，对该融合蛋白的表达纯化和复性进行了探索，并利用高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis, HPCE）技术对复性后的重组蛋白进行检测分析，以进一步了解该重组蛋白的基本理化特点，检测该蛋白的活性。