1 材料和方法
1.1 材料
台式低温高速离心机、台式冷冻离心机和PA800毛细管电泳仪（Beckman Coulter公司）；Mini VE垂直电泳系统（GE Healthcare公司）；原核表达质粒pET14b/MCS-EGFP及pET14b/EGFP-hCRP（分别由广东省蛋白质组学重点实验室郭爱华和陈腾祥构建）；大肠杆菌菌株DH5α（本室保存）；质粒纯化试剂盒（U-Gene公司）；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG）由Calbiochem公司生产；microcon YM-10超滤浓缩装置（Millipore公司）；TALON Metal Affinity Resin（BD Bioscience Clontech公司）；透析袋（Merck公司）；人单核细胞系THP-1（香港大学医学院徐爱民教授惠赠）；无内毒素的RPMI-1640培养液和胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）由Hyclone公司生产；protease inhibitor cocktail（sigma公司）。
1.2 方法
1.2.1 质粒pET14b/MCS-EGFP和pET14b/EGFP-hCRP的原核表达
用pET14b/MCS-EGFP及pET14b/EGFP-hCRP分别转化BL21（DE3）大肠杆菌菌株，各挑取3个克隆到5 ml LB培养液（Amp+）中，37 ℃振荡扩增，当菌液OD值约为0.4时，加入5 μl 100 mmol/L IPTG到5 ml的菌液中，室温振荡4 h，取1 ml菌液3 000 r/min离心5 min，加入200 μl 1倍SDS上样缓冲液重悬沉淀，进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察蛋白表达情况。各取表达目的蛋白的克隆1 ml加入到200 ml LB培养液（Amp+）中，按上述表达条件进行大量诱导表达。
1.2.2 His-EGFP蛋白的纯化
按TALON Metal Affinity Resin试剂盒说明书，配制结合缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。200 ml转化了质粒pET14b/MCS-EGFP的大肠杆菌经室温诱导4 h后， 4 ℃ 8 000 r/min离心菌液10 min，用4 ml 冰冷的结合缓冲液重悬细菌沉淀，超声波裂解，4 ℃ 12 000 r/min离心20 min，取上清加入到装有TALON Metal Affinity Resin的纯化柱中，按操作说明进行亲和色谱纯化。洗脱得到的纯化蛋白用Bradford方法定量。
1.2.3 His-EGFP-CRP蛋白的纯化
配制缓冲液A（50 mmol/L Tris-HCl、0.5 mmol/L EDTA、50 mmol/L NaCl、5％甘油、0.5 mmol/L DTT，pH 7.9）。200 ml转化了质粒pET14b/MCS-EGFP-CRP的大肠杆菌经室温诱导4 h后， 4 ℃ 8 000 r/min离心菌液10 min，用10 ml含 5％TritonX-100缓冲液A重悬沉淀，超声波裂解细菌，4 ℃ 12 000 r/min离心20 min。沉淀（主要为包涵体和细菌碎片）转入5 ml的玻璃匀浆器内，加入10 ml含5％TritonX-100的缓冲液A充分匀浆沉淀，室温静置20 min，匀浆液离心后取沉淀重复匀浆洗涤1次。加入10 ml含3％十二烷基肌氨酸钠（SKL）和0.3％十二烷基硫酸钠（SDS）的buffer A，充分重悬沉淀，静置60 min以缓慢溶解包涵体。溶解产物4℃ 12 000 r/min 离心20 min，取上清加入到microcon YM-10中，超滤浓缩到原体积的1/2。然后加入到TALON Metal Affinity Resin的纯化柱中，进行亲和色谱纯化。洗脱得到的纯化蛋白用Bradford方法定量。
1.2.4 SDS-PAGE检测质粒原核表达和蛋白纯化情况
分别取少量未转化质粒的BL21（DE3）、诱导表达的转化子、转化子菌液裂解后的离心沉淀物及上清、亲和纯化的洗脱液，加入SDS上样缓冲液，进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色观察蛋白表达和纯化情况。
1.2.5 蛋白质重折叠复性及缓冲液置换
上述亲和纯化得到的His-EGFP和His-EGFP-CRP蛋白液分别加入到截留分子量为10 kD透析袋中，放入到500 ml含0.5 mmol/L DTT的Buffer A中，4 ℃透析12 h，每3 h更换透析液；将透析袋放入另一个500 ml的透析体系（含1 mmol/L GSH、0.2 mmol/L GSSG和0.6 mmol/L L-精氨酸的PBS）中，4 ℃透析12 h，每3 h更换透析液；最后放入500 ml PBS溶液中，4 ℃透析3 h，重复4次。用0.22 μm的滤膜过滤除菌，Bradford方法定量，分装后贮存于-80 ℃。