正常成人肝组织中BMP9读码框架的克隆(2)

    6期杨堃，刘相萍，隋爱华,等. 正常成人肝组织中BMP?9读码框架的克隆521
    5 μL；Enzyme Mix 2 μL；Total RNA 2 μg；加RNase?free water至50 μL。 逆转录反应条件：50 ℃ 30 min，95 ℃ 15 min灭活逆转录酶。PCR循环参数：94 ℃ 1 min、52 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，共35个循环，终末72 ℃ 延伸10 min。在10 g/L的琼脂糖凝胶上进行RT?PCR扩增产物的电泳分析。
    仔细切下琼脂糖凝胶中的目的条带，按QIAGEN公司提供的QIAquick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒操作步骤进行PCR产物的凝胶回收。
    1.4  重组真核表达载体的构建及转化感受态大肠杆菌
    将高效真核表达载体pcDNA4/HisMax和胶回收PCR产物分别行BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切。酶切反应产物纯化后，T4连接酶进行连接反应。连接反应产物转化感受态大肠杆菌JM109，氨苄青霉素抗性筛选。碱裂解法提取带抗性基因质粒。
    1.5  重组载体限制性酶切分析及DNA测序
    将所提取的质粒进行BamH Ⅰ与Xba Ⅰ双酶切鉴定,将初步鉴定为带有插入片段的重组质粒送往上海生工生物技术有限公司进行DNA测序。
    2  结    果
    2.1  RT?PCR检测
    以成人肝组织总RNA为模板进行RT?PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图1。产物大小约1.3 kb，符合人BMP?9在GenBank中的开放读码框架序列大小。
    2.2  重组载体限制性酶切分析
    未经重组pcDNA4/HisMax载体经BamH Ⅰ与Xba Ⅰ双酶切后，产生约5.3 kb大小线性化载体DNA（图2）。重组pcDNA4/HisMax?BMP9载体经BamH Ⅰ与Xba Ⅰ双酶切后，产生约5.3、1.3 kb大小线性载体及BMP?9两条片段（图2）。

   2.3  DNA测序
    将酶切鉴定后的重组质粒进行DNA测序，测序结果与BMP?9在GenBank中的开放读码框架序列完全一致，表明获得的目的基因正确。
    3  讨    论
    BMPs为TGF?β超分子家族中的一个特殊亚族，其在皮下注射后具有诱导异位骨形成的能力。在发育和（或）生长过程中，BMP的信号传递对于生物体非常重要[3]。BMP?9是引人关注的BMPs家族的一员，其在骨代谢及其他很多方面具有重要的临床应用价值。
    BMP?9首先从胎鼠肝cDNA文库进行了克隆，表现出与细胞特异性受体的结合特性[4]。MILLER等[4]描述了BMP?9的细胞表达和受体结合特性。研究显示，成年鼠BMP?9主要出现于肝脏。肝脏的非实质细胞、肝星形细胞和肝内皮细胞(LEC)等表达BMP?9。研究发现，BMP?9信号通过自分泌和（或）旁分泌机制在肝窦中触发。BMP?9在减少肝细胞中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）的表达和在肌管中激活丝?苏氨酸激酶（Akt）有确切作用 [2]。
    在神经系统中，BMP?9的作用主要包括两方面。首先，BMP?9促进胚胎原始神经元的乙酰胆碱合成[5]。来自胚胎鼠的原始细胞，在细胞培养中加入rhBMP?9可呈时间?浓度依赖增加细胞产生乙酰胆碱。还可诱导胆碱乙酰基转移酶和乙酰胆碱小泡转运体的表达[6]。BMP?9与碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对神经系统发育起协调作用，bFGF促进原始细胞的增殖，保持原始细胞特性的一致，BMP?9则促进细胞分化，保持种族特异性。
    BMP?9还在调节造血干细胞的生长中有双向作用[7]：体外高浓度BMP?9有抑制体外克隆造血祖细胞集落形成单位的增长效应，低浓度BMP?9则显著促进体外克隆造血祖细胞集落形成单位增殖。