中国科学技术大学博士论文
第二部分 从18SrDNA序列分析虫霉目属间的
亲缘关系
第一节 前言
虫霉目（Entomophthorales）真菌是害虫生物防治的重要资源，全世界已发
现200余种（李增智，2000），多数为昆虫的专性病原菌。其中有些种类分布极广，是许多昆虫常见流行病的病因，对某些害虫种群起着重要的自然控制作用（冯明光，1997）。
许多学者之所以开展利用虫霉进行害虫的生物防治方面的研究工作，是因为虫霉具有以下引人注目的特点（李增智，1984）：①在适合的条件下能引起大规模的流行病，如：20世纪60年代初Cherwonogradzky（1980）发现，加拿大西部大发生的蝗虫种群遭到了蝗噬虫霉（Entomophaga grylli（Fresenius）Batko）流行病的灭顶之灾，在病害流行期间，蝗虫死亡率达95％。又如世界广布的虫霉新蚜虫疠霉（Pandora neoaphidis（Remaudiere & Hennebert）Humber）在十字花科蔬菜和小麦蚜虫中绵延不绝的流行，对中国乃至世界的蔬菜生产有极其重要的意义；②有效的活体营养方式：感病活虫仍能到处活动，从而有利于其扩散传播；③独特的扩散形式：多数种类的分生孢子能强烈弹射，重复发芽并具粘性，接触虫体后不宜被雨淋失，④可靠的宿存机制：多数种在生活史中具厚壁的休眠孢子，其抗逆性强，寿命长，在生态系中可宿存多年而不丧失生命力；⑤较快的侵染过程，能较有效地利用短暂的阴雨天气迅速形成流行高峰；⑥适度的寄主专化性，既不像昆虫病毒之窄，又不如白僵菌之广，不必担心对非目标昆虫造成影响，比较符合综合治理的要求。
本世纪以来，在应用虫霉中有三种策略：①真菌杀虫剂；②自然流行病的利用和强化；③异地引种。由于对于虫霉菌难以培养、生产和储藏以及休眠孢子发芽不同步等问题的研究尚无突破，故现阶段真菌杀虫剂策略一直未得到田间的实际运用，这是一个亟待加强的重要研究领域。近三十年来有人提出强化地方病的应用策略（李增智，1989），由于虫霉独特的生物学特点和显著的流行潜力，因此是应用虫霉的新起点，黄耀坚等（1992）已通过在蘑菇房中诱发菇蚊流行病的实践予以证实。在澳大利亚和美国纽约州，将根虫瘟霉（Zoophthora radicans
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（Brefeld）Batko）异地引种并分别成功地诱发了车轴草彩斑蚜和叶蝉的虫霉流行病（Milner et al.，1982；Wraight et al.，1986）。引种实验的成功意味着，异地引种使之在当地定殖并发挥对害虫的自然控制作用将是很有意义和必要的。
虫霉分类学是研究虫霉的基础，始于19世纪50年代。德国人Cohn以蝇虫霉Empusa muscae Cohn为模式种建立了多枝虫霉属Empusa。因该属名已见于兰科植物，故Fresenius于翌年代之以虫霉属（Entomophthora Fresenius）。自此，许多学者发表了大量的新种和提出一些有价值的分类系统，其中在虫霉资源调查和研究中，美国人Thaxter（1888）、英国人Petch（1944）、瑞典人Gustafsson（1965a, 1965b）、瑞士人Keller（1987，1991）、波兰人Balazy（1993）和中国人李增智（2000）分别详细地查清了各自国家的虫霉资源。此外，Batko、Drechsler和Humber在新分类单元的发现上贡献也较为突出。100多年来，虫霉目的分类一直十分混乱，系统多出，异名林立，使应用者应接不暇。在科级水平上，虫霉目在20世纪80年代前，一直只被视为1科虫霉科（Entomophthoraceae Nowakowski 1887），Benjemin 1979年承认了1927年建立的蛙粪霉科（Basidiobolaceae Clausen in Engler & Gilg）；此后Ben-Ze’ev & Kenneth（1982a，1982b）在他们的3科16属系统中（新巴氏系统）中又认可了1883年建立的新月霉科（Ancylistacaeae）。5年后，这两位学者又以新属Thaxterosporium为模式属建立了第四个科――新接霉科（Neozygitaceae）。在Humber（1989）最新的6科21属的系统中，新建了2个科：顶裂霉科（Meistacraceae）和蕨霉科（Completoriaceae）。至于属的系统沿革一直比较复杂，经许多学者系统的研究修订，目前属的分类标准也日趋合理，此中贡献较大的当数Batko、Ben-Ze’ev & Kenneth和Humber。Batko于1964－1966（1964a，1964b，1964c，1964d）年间作了最大胆的尝试形成了较先进的巴氏分类系统：他将Empusa分为Entomophthora、噬虫霉属（Entomophaga）和Culicicola（此后的系统皆不承认此属），将Triplasporium从亚属上升为属，而将原Entomophthora中单核的种集中建立Zoophthora属，并随之将其分为4个亚属：Zoophthora、Erynia、Pandora和Furia。1965年，他和Weiser又将单核、双囊壁和分生孢子梗不分枝的种类划为Strongwellsea属。在Ben-Ze’ev & Kenneth（1982a，b）的新巴氏分类系统（Neobatkoan Classification）中，在Erynia（=Zoophthora of Batko ）属中的亚属处理上和巴氏分类系统不尽相同。他们修订了Zoophthora亚属和Erynia亚属，以Neopandora为亚属名代替了Pandora亚属，并且否定了Furia亚属。将Conidiobolus属划分为三个亚属：德拉霉亚属Deloacroixia、毛管孢亚属Capillidium和耳霉亚属Conidiobolus。在Humber（1989）的分类系统中，将巴氏分类系统的四个亚属全部上升为属，从Conidiobolus属中分出新属Batkoa。
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自Humber提出该系统以来，已逐渐为一些学者所认可，1995年出版的“Ainsworth And Bisby’s Dictionary of The Fungi”第8版承认了该系统，故本研究所涉及到的虫霉目的各个种，将按Humber系统分属。
目前对虫霉目真菌系统发育和分子进化上也有所研究，Nagahama等（1995）和Jensen等（1998）选用小亚基rDNA为靶分子，用测序的方法，研究了虫霉目中的10种有代表性的种，得出了一些有意义的结论，有些和传统分类系统相吻合，但有些却与经典分类相矛盾。Silver（1995）也测定了灯蛾噬虫霉Entomophaga aulicae（Reichard）完整的核基因组的rDNA基因重复单位，约有6300bp。Cigelnik（1999）用同样的方法研究了接合菌中的人体病原菌的系统发育关系，其中包括3种耳霉和2种蛙粪霉。但总的来说，对虫霉目的分子系统学研究不够深入和完善，我们和美国著名的虫霉专家Humber博士合作，计划进一步研究虫霉目的分子系统学。基于两点考虑1. 对虫霉目中一些种小亚基rDNA已有所研究，故分子数据可充分利用。2. 虫霉目的ITS在同一个属内的不同种，其长度变化较大，这已为Rohel（1997）所证实，同时我们在前期的预备性研究中也同样发现不同属的ITS长度差异更大，短的仅有500bp，长的可达2000bp（未发表）。因此ITS不适合系统树的构建。3. 小亚基rDNA基因在真菌中是较保守的，适宜于不同目、科和属等阶元的系统发育分析。故在我们的研究中仍然选用了小亚基rDNA为靶分子。本研究主要拟解决4方面的问题，1. Humber系统中关于四个亚属的提升是否恰当，以及对广义虫疫霉属（Erynia sensu lato）究竟如何处理。2. 耳霉中划分三个亚属是否符合自然系统。3. 确定一些有争议属的地位和疑难种的种的地位。4. Humber的未发表的新属裂梗霉属Schizangiella Humber （gen. nov., unpubl.）是否可被接受。对一些未研究且难以培养的一些属，如巴科霉属（Batkoa）和新接霉属（Neozygites），在本研究中，因培养未获成功，故暂未能研究其分子系统。
第二节 材料与方法
一、材料
菌株及来源：42株虫霉目真菌的菌株号、种类和寄主见表1。在菌株号左上方用星号标记的是本次研究的24种虫霉目真菌，由美国农业部植保研究所植物、土壤和营养实验室的Humber博士惠赠。其它的18株虫霉目真菌系由4个不同的国外研究小组研究，由GenBank中查得。
表1本次和其它研究小组研究的虫霉目真菌的菌株号、种类、寄主及登录号
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登录号
菌株号 Strains
种类 species
Basidiobolus haptosporus Drechler (1)
*ARSEF263
固孢蛙粪霉
Basidiobolus haptosporus Drechler (2)
NRRL28635
固孢蛙粪霉
Basidiobolus microsporus Drechler
*ARSEF265
小孢蛙粪霉
Basidiobolus ranarum Eidam (2)
IFO9117
蛙生蛙粪霉
Basidiobolus ranarum Eidam (1)
NRRL20525
蛙生蛙粪霉
*ARSEF452
布雷弗尔德耳霉
Conidiobolus coronatus (Costantin) (2)
F943
冠耳霉
Conidiobolus coronatus (Costantin) (1)
NRRL28638
冠耳霉
Conidiobolus coronatus (Costantin) (3)
NRRL1912
冠耳霉
Conidiobolus firmipilleus Drechler
*ARSEF2731
牢盖耳霉
Conidiobolus incongruus Drechler
NRRL28636
异孢耳霉
Conidiobolus lamprauges Drechler
NRRL28637
光亮耳霉
Conidiobolus obscurus (Hall & Dunn)
*ARSEF3088
暗孢耳霉
Conidiobolus osmodes Drechler
*ARSEF79
有味耳霉
*ARSEF453
微耳霉
植物碎屑
TT
寄主
Accession
Hosts
no.
Lizard dung
AF368504 蜥蜴粪便
? Lizard dung
AF368505 蜥蜴粪便
?
D29946 AF113413
?
Conidiobolus brefeldianus Couch
?
AF113414
AF368506 ? D29947
? AF113418
?
Plutella xylostella
AF113417
AF368507 (Lepidoptera: Plutellidae)
?
AF113419
?
Rhopalosiphum maidis
AF113420
AF368508 (Homoptera: Aphididae)
Hypera variabilis
AF368510 (Coleoptera:Curculionidae)
Plant detritus
AF368511 Conidiobolus pumilus Drechler
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*ARSEF448
皱孢耳霉
Conidiobolus thromboides Drechler (1)
ARSEF115
块状耳霉
Entomophaga aulicae (Reichard)
FPMI646
灯蛾噬虫霉
Entomophaga conglomerata (Sorokin)
*ARSEF2273
堆聚噬虫霉
Entomophthora culicis (Braun)
*ARSEF387
库蚊虫霉
Entomophthora muscae (Cohn)
F1020
蝇虫霉
Entomophthora schizophorae
ARSEF2541
Kell.&Wild.实蝇虫霉 Erynia conica (Nowakowski)
*ARSEF1439
锥孢虫疫霉
Erynia rhizospora (Thaxter)
*ARSEF1441
根孢虫疫霉 Erynia sciarae (Olive)
*ARSEF1870
蕈蚊虫疫霉
Eryniopsis caroliniana (Thaxter)
*ARSEF641
卡罗来纳拟虫疫霉 Eryniopsis ptycopterae Keller
ARSEF2671
细腰拟虫疫霉 Furia ithacensis (Kramer)
*ARSEF1339
伊萨卡虫瘴霉
Furia neopyralidarum (Ben-Ze’ev)
*ARSEF1145
新螟虫瘴霉
Furia pieris (Li & Humber)
*ARSEF781
粉蝶虫瘴霉
Macrobiotophthora vermicola
ARSEF 650
(McCullock) 线虫缓步霉
*ARSEF217
Pandora blunkii (Lakon ex Zimmerman)
(Nematoda, Rhabditidae) Plutella maculipennis (Lepidoptera: Pieridae) Cruznema lambdiense
Pieris rapae (Lepidoptera) (Diptera: Empididae)
(Diptera) (Diptera: Tipulidae) Ptycoptera contaminata (Diptera:Mycetophilidae)
Tipula paludosa (Trichoptera)
Adult
(Diptera:Simuliidae)
Adult (Diptera) Simulium sp. Psilia rosae
?
(Diptera: Nematocera) (Diptera:Chironomidae)
(Lepidoptera)
Adult
(Homoptera, Aphididae) Choristoneura fumiferana
腐烂的蔬菜碎屑 Therioaphids maculata
T
Conidiobolus rhysosporus Drechler Decaying vegetable detritus
AF368512 AF052401
U35394
AF368509 AF368516 D29948
AF052402
AF368513 AF368514 AF368515 AF368517 AF052403
AF351134 AF368518 AF368519 AF052400 AF368520 31