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混匀后，加入20?l（1滴）灭菌的液体石蜡油覆盖于反应混合液的表面以防止样品在反复的加热-冷却过程中蒸发。
3、反应循环参数
95℃ 3min 模板DNA变性 94℃ 1min 变性 54℃ 1min 退火 72℃ 2min 延伸
共循环反应35轮，在最后一个循环72℃延伸反应10min后结束反应。按上述反应条件于PCR仪中进行扩增（PCR仪为英国Techine LTD.公司生产）。
4、扩增产物的检测
① 用100?l氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油，将上相液转至一只新的无
菌离心管中。
② 取5?l进行1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。剩余样品置于-20℃冻存，以备进一
步分析使用。
（六）DNA扩增产物的纯化
PCR产物因含有未反应的dNTP、引物、Taq酶和一些无机离子以及DNA样品中的一些杂质而影响克隆效果，克隆前有必要对PCR产物进行纯化（郭成亮，1995）。购买Promega公司的WizardTMPCR Preps DNA Purification System，按说明书提供的方法即可完成PCR产物的快速纯化，同时对PCR产物皆起浓缩功能（50-300?l扩增产物可浓缩为50?l）。WizardTMPCR Preps DNA Purification System纯化试剂盒，包括纯化缓冲液、纯化树脂和小型纯化柱，纯化方法如下： 1、将一支无菌的5ml注射剂的活塞抽出，将纯化系统的小型纯化柱安装于注射 器头部。
2、取纯化缓冲液100?l加入1.5ml离心管中，再加入250?l PCR产物（注意尽 量不带入石蜡油），轻轻转动使其混合。
３、震荡DNA纯化树脂使其中的结晶完全溶解，取1ml加入装有纯化缓冲液和 PCR产物的离心管中，慢慢转动混匀。
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４、将由步骤（3）所得混合物移入装有纯化柱接头的注射器内，插入活塞慢慢 将待纯化的混合物压入纯化柱内。
５、从注射器上取下纯化柱，退出活塞后，再把纯化柱重新安装到注射器上，取 2ml 80%的异丙醇加入注射器，插入活塞慢慢使溶液通过小纯化柱。 ６、将纯化柱取下安装到1.5ml离心管上，12000g离心20s，去掉异丙醇，并 将纯化柱在室温中放置15min，以挥发残存的异丙醇。
７、将纯化柱转移到一支新的1.5ml离心管上，加入50?l灭菌的双蒸水中静置
1min，12000g离心20s，将DNA洗脱出来，去掉纯化柱，纯化DNA于 -20℃保存备用。
（七）T载体的制备
1、CaCl2制备新鲜感受态细胞
（1） 挑单菌落（XL1－Blue菌株由中国科学院微生物研究所刘小勇先生惠赠）
于4mlLB培养基中，于37℃，250rpm剧烈摇晃下培养过夜。
（2） 取20?l过夜的培养液加入4mlLB培养基于于37℃，250rpm剧烈摇晃下培
养约2.5h，其OD600值大约为0.3。
（3） 在微量离心机上4℃，5,000g离心10min，弃上清，用1ml预冷的0.1M CaCl2
重悬菌体（可用振荡器振荡）。
（4） 在微量离心机上4℃，5,000g离心10min，弃上清，用0.2ml预冷的0.1M
CaCl2重悬菌体，所得即为感受态宿主菌，4℃保存。
2、热激转化
（1） 取7.5?l SK质粒（由中国科学院研究所微生物刘小勇先生惠赠）加入200?l
新鲜制备感受态细胞中。
（2） 轻轻旋转混匀，冰水浴中放置30min。 （3） 42℃热激90s后，立即放回冰水浴2min。
（4） 补加LB培养液（无抗生素）800?l于37℃100rpm摇动45min。 （5） 在微量离心机中4℃ 5,000转中离心10min。 （6） 弃上清，加200?l LB培养基重悬，振荡均匀。
（7） 取40?l转化的细菌，于7?l IPTG（20mg/ml）、50?l X－gal（20mg/ml）用
灭菌的涂布棒混匀，铺于一个SOB平板（含有60?l /ml的Amp青霉素）于37℃培养16h，平板中全部出现蓝斑。将平板于4℃冰箱中保存备用。
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3、细菌的培养
用灭菌的Tip头挑单菌落，于4mlLB培养基（含抗生素）中，于37℃，250rpm剧烈摇晃下培养过夜。
4、碱裂解法小量制备质粒DNA
（1）将1.5ml细菌培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以12,000g离 心30s，倒上清。
（2）于4℃12,000g瞬时离心，用移液器吸去底部剩余培养液。
（3）将细菌沉淀重悬于100?l用冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡。放置冰水浴中5min。 （4）加200?l新配制的溶液Ⅱ,盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。 将离心管放置于冰上5min。
（5）加150?l用冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，将管倒置后温和的振荡10s使溶 液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上5min。 （6）用微量离心机于4℃以12,000g离心10min，将上清转移到新离心管中。 （7）用2倍体积的乙醇于室温沉淀质粒DNA，振荡混合于室温放置10min。 （8）用微量离心机于4℃以12,000g离心10min。
（9）小心吸上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以便所有液体流出。再将附 于管壁的液滴除尽。
（10）用1ml 70％乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，按步骤（9）所述方法除掉上 清，在空气中使核酸沉淀干燥10min。 （11）用200?l灭菌的双蒸水重新溶解核酸，振荡。
（12）加入5?l 10mg/ml RANase，在37℃水浴锅中保温30min。
（13）加等体积氯仿异戊醇溶液，并剧烈振荡使之形成悬乳状，抽提10min。 （14）13,000g离心10min，用移液器将上清移至干净的Eppendorf管中。 （15）上清液中加入等体积的氯仿－异戊醇，如上操作，再提取一次，移入新管。 （16）加入1/10体积的NaAc，再加入2倍体积的冷乙醇，上下转动，放入冰箱 20min，使DNA沉淀，12,000g离心10min收集沉淀。 （17）用1ml 80％的冷乙醇将沉淀洗涤5min，洗涤两次。
（18）除掉乙醇并在空气中空干15min，将DNA溶于100?l灭菌的双蒸水， －20℃保存备用。
5、SK质粒的酶切开环
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（1）在酶切反应管内加入： 10×BufferD 9?l
SK 60?l（约18μg） 加水至85?l
（2）向反应管内加5?l EcoRⅤ内切酶（20U/?l）（购自华美生物工程公司），于 37℃温育3h。 （3）取2?l电泳检测。 （4）加水12?l补足100?l
（5）加等体积氯仿异戊醇（24：1）溶液，并剧烈振荡使之形成悬乳状，抽提10min。 （6）13,000g离心10min，用移液器将上清移至干净的Eppendorf管中。 （7）加入1/10体积的NaAc，再加入2倍体积的冷乙醇，上下转动，放入冰箱 20min，使DNA沉淀，12,000g离心10min收集沉淀。 （8）用1ml 80％的冷乙醇将沉淀洗涤5min，洗涤两次。
（9）除掉乙醇并在空气中空干15min，将DNA溶于60?l灭菌的双蒸水， －20℃保存备用。
6、T－vector的制备
（1）在连接反应管中加入： 10×Buffer 10?l MgCl2（15mM） 10?l dTTP（20mM） 10?l SK质粒/ EcoRⅤ 60?l 加水至98?l
（2）向反应管内加2?l Taq酶（5U/?l） （购自华美生物工程公司）于70℃温 育3h。
（3）加等体积氯仿异戊醇溶液，并剧烈振荡使之形成悬乳状，抽提10min。 （4）13,000g离心10min，用移液器将上清移至干净的Eppendorf管中。 （5）加入1/10体积的NaAc，再加入2倍体积的冷乙醇，上下转动，放入冰箱 20min，使DNA沉淀，12,000g离心10min收集沉淀。 （6）用1ml 80％ 的冷乙醇将沉淀洗涤5min，洗涤两次。
（7）除掉乙醇并在空气中空干15min，将DNA溶于100?l灭菌的双蒸水， －20℃保存备用。
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（八）DNA扩增产物的克隆
1、18SrDNA扩增产物和T－vector的连接反应 （1）在连接反应管中加入：
10×Ligase Buffer 1?l T－vector 1?l 18SrDNA （纯化产物） 1.5?l 加水至9.9?l 10×Ligase Buffer包括：
500mM/L Tris-HCl（pH7.6） 100mM/L MgCl2 100mM/L二硫苏糖醇 500?g/ml牛血清白蛋白
（2） 向反应管内加0.1?l T4 Ligase（8U/?l）（购自华美生物工程公司）于15℃ 温育4h。
2、CaCl2制备新鲜感受态细胞同前所述
3、热激转化
（1）取7.5?l连接反应液加入200?l新鲜制备感受态细胞中。 （2）以下步骤同本部分中的“T载体的制备”热激转化
（九）含重组质粒的细菌菌落的鉴定
1、菌落PCR（粗筛）
（1）按以下次序，将各物质加入一只无菌的0.2ml薄壁离心管中：
10×扩增缓冲液 2?l dNTP（5?M） 1.6?l nu-SSU-0021-5'（10?M） 1?l nu-SSU-1780-3'（10?M） 1?l Taq DNA聚合酶（5U/?l） 0.2?l 灭菌双蒸水 14.2?l
混匀后，用灭菌的Tip头蘸取白斑（此斑用记号笔标记）移入反应液中, 再
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