中国科学技术大学博士论文
布伦克虫疠霉 Pandora delphacis (Hori)
*ARSEF459
飞虱虫疠霉
Pandora dipterigena (Thaxter)
*ARSEF397
双翅虫疠霉
Pandora kondoiensis (Milner)
*ARSEF825
近藤虫疠霉
Pandora neoaphidis (Remaud. & Henn.)
ARSEF5403
新蚜虫疠霉
Schizangiella serpentis Humber (sp.
*ARSEF203
nov., unpubl.)蛇裂梗霉
Strongwellsea castrans Batko & Weiser
绝育斯魏霉
Zoophthora anglica (Petch)
*ARSEF396
英吉利虫瘟霉
Zoophthora occidentalis (Thaxter)
*ARSEF3073
西虫瘟霉
Zoophthora radicans (Brefeld) (2)
KVL610
根虫瘟霉
Zoophthora radicans (Brefeld) (1)
F853
根虫瘟霉
(Lepidoptera: Plutellidae) Nephotettix cincticeps
AF368521
(Homoptera: Cicadellidae) (Diptera: Nematocera)
AF368522
Acythosiphon kondoi
AF351133 (Homoptera: Aphididae)
Sitobion avenae
AF052405
(Hemiptera) Crotalus horridus
AF368523 (Squamata: Viperidae)
Delia radicum
AF052404
(Diptera) Agriotes sputator
AF368524 (Coleoptera: Elateridae) Acythosiphon pisum (Homoptera: Aphididae) Epinotia aporema
AF052404
(Lepidopera)
?
D61381 AF368525 注：带有星号的菌株，为本次所研究；带有下划线的序列登录号为我们在GenBank中所注册
二、方法
（一）萨氏葡萄糖蛋黄牛奶培养基的制作
将3个新鲜的鸡蛋放入200ml 70％酒精（内加2ml丙酮）液中浸泡2h，灭菌。称取葡萄糖11.9g，蛋白胨4.5g，琼脂8.9g，加入水480ml，加热至沸腾，再用二层纱布过滤，倒入三角瓶中，加塞，在1.5Kg/cm2压力下灭菌15min，灭菌后放在60℃水浴锅中，制得萨氏葡萄糖琼脂培养基（SDA），同时取新鲜牛奶51ml在1.0Kg/cm2压力下灭菌20min。在超净工作台中将灭菌的鸡蛋上的酒精，在酒精灯上烧净，无菌地将蛋打开，将其蛋清倒掉，蛋黄倒入灭菌的烧杯中，再和已降至
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60℃的SDA培养基、牛奶混合，用灭菌玻璃棒充分搅匀，再倒皿，凝固后加入同皿大小的灭菌玻璃纸。放置4℃冰箱备用。
（二）菌体培养
将供试菌株的菌丝，接至萨氏葡萄糖蛋黄牛奶培养基之上，置于光照培养箱中培养14天（18℃），从玻璃纸上剥离菌体，冷冻真空干燥，备用。
（三）溶液配制
1、DNA提取液
100mM Tris-HCl（PH9.0） 40mM EDTA（PH8.0） 2、10% SDS
10g SDS定容至100ml（注意：在气温较低的环境中，会有部分SDS析出， 使用前将溶液在50℃水浴锅中将其完全溶解。） 3、3M NaAc（PH5.2）
4、10mg/ml Rnase（Dnase-free）：用前100℃10min灭活Dnase 5、氯化苄（分子式PhCH2Cl）：北京化学试剂厂分析纯原液。 6、1×CTAB DNA提取液（参考Doyle，1991；Sambrook，1989）
1%（W/V）CTAB 10mM Tris-HCl（PH8.0） 20mM Na2EDTA 1.4M NaCl 7、TE缓冲液
10mM Tris
1mM EDTA（PH8.0） 8、5×TBE电泳缓冲液
0.45M Tris 0.45M硼酸
20ml 0.5M EDTA（PH8.0）加水定容至1000ml 9、0.5M EDTA（PH8.0）
18.612g EDTA-Na2加水70ml，用10N的NaOH调PH值至8.0后，定容至
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100ml。
10、上样缓冲液（Loading buffer）（6×）
0.25%溴酚兰
40%（W/V）蔗糖水溶液 11、溴化乙锭贮液（EB）（10mg/ml）
1g溴化乙锭
100ml水 室温闭光保存 12、氯仿：异戊醇（24：1） 13、80%乙醇
14、LB培养基（Luria-Bertani培养基）
配制每升培养基，应在950ml去离子水加入： 细菌培养用胰化蛋白胨（bacto-trytone） 10g 细菌培养用酵母提取物（bacto-yeast extract） 5g NaCl 10g
摇动容器直至溶质完全溶解，用5mol/L NaOH（约0.2ml）调节PH7.0，加入去离子水至总体积为1L，在15 lbf/in2（1.034×105Pa）高压下蒸气灭菌20min。 15、SOB培养基
配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入： 细菌每升用胰化蛋白胨（bacto-trytone） 20g 细菌培养用酵母提取物（bacto-yeast extract） 5g NaCl 0.5g
摇动容器使溶质完全溶解，然后加入250mmol/L KCl溶液10ml（在100 ml去离子水中溶解1.86g KCl配制成250mmol/L KCl溶液），用5mol/L NaOH（约0.2ml）调节PH7.0，加入去离子水至总体积为1L，在15 lbf/in2（1.034×105Pa）高压下蒸气灭菌20min。
该溶液在使用前加入5ml经灭菌的2mol/L MgCl2溶液[在90ml去离子水中溶解19g MgCl2，然后加入去离子水至总体积为100ml，在15 lbf/in2（1.034×105Pa）高压下蒸气灭菌20min]和20ml经灭菌1mol/L MgSO4溶液[在180ml去离子水中溶解24.1g MgSO4，然后加入去离子水至总体积为200ml，在15 lbf/in2（1.034×105Pa）高压下蒸气灭菌20min]，该培养基在倒皿前使其温度降至60℃左右加入氨苄青霉素1.2ml（50mg/ml）。 16、50mg/ml氨苄青霉素
0.5g氨苄青霉素粉剂溶于10ml灭菌的双蒸水，然后通过0.22?m滤器过滤除
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菌于-20℃保存。 17、1mol/L CaCl2
在200ml纯水中溶解54g CaCl2·6H2O，用0.22?m滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。 18、20mg/ml X-gal
X-gal为5-溴-4-氯-3-吲哚-?-D-半乳糖苷，100mg X-gal溶于5ml二甲基甲酰胺。保存于聚丙烯管中，装有X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏，并应贮存于-20℃，X-gal溶液无须过滤除菌。 19、IPTG溶液
IPTG为异丙基硫代-?-D-半乳糖苷，在4ml蒸馏水中溶解1IPTG后，用蒸馏水定溶至5ml，用0.22?m滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮于－20℃。 20、溶液Ⅰ
50mmol/L葡萄糖
25mmol/L Tris-HCl（PH8.0） 10mmol/L EDTA（PH8.0）
溶液Ⅰ可成批配制，每瓶约100ml，在10 lbf/in2（6.895×104Pa）高压下蒸气灭菌15min，贮存于4℃。 21、溶液Ⅱ（现配现用）
0.2mol/L NaOH（临用前用5mol/L贮存液现用现稀释） 1% SDS
22、溶液Ⅲ
5mol/L乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml
（四）DNA提取（朱衡等，1994）
1、0. 1g菌体加入0.5ml提取液，振荡使之与菌体充分混匀，再加入0.1ml 10％ SDS、0.3ml氯化苄，剧烈振荡，使管内混合物成乳状。 2、在50℃保温1h，每隔10min振荡混合一次。
3、加入0.3ml 3M NaAc（PH5.2）混匀，冰水浴15min，6000转4℃离心15min。 4、取上清加入等体积的异丙醇室温沉淀20min。
5、10,000转室温离心15min，沉淀用70％乙醇洗一次，空干15min后，溶于500ml
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TE中。
6、加入5?l 10mg/ml RANase，在37℃水浴锅中保温30min
7、加等体积氯仿异戊醇（24：1）溶液，并剧烈振荡使之形成悬乳状，抽提5－ 10min。
8、1300g离心10min，用移液器将上清移至干净的Eppendorf管中。
9、上清液中加入等体积的氯仿－异丙醇，如上操作，再提取一次，移入新管。 10、加入1/10体积的NaAc，再加入等体积冷异丙醇，上下转动，可见有絮状沉 淀析出，放入冰箱至过夜，使DNA沉淀，12,000g离心10min收集沉淀。 11、用1ml 80％ 的冷乙醇将沉淀洗涤5min，洗涤两次。
12、除掉乙醇并在空气中空干15min，将DNA溶于50?l TE缓冲液中，－20℃ 保存备用。
13、在0.8%的Agrose胶上检测DNA的质量和浓度。
（五） 18SrDNA基因的特异性PCR扩增
1、PCR反应所需的Taq酶和dNTP分别购置上海生工生物工程公司和Promega
公司。PCR扩增反应：参照Jensen等（1998）扩增虫霉目18SrDNA基因所用引物
nu-SSU-0021-5’（CTGGTTGATTCTGCCAGT）和
nu-SSU-1780-3’
（AATGATCCTTCCGCAGGT），引物由上海Sangon公司合成。
2、按以下次序，将各物质加入一只无菌的0.2ml薄壁离心管中：
10×扩增缓冲液* 5?l dNTP（5?M） 8?l nu-SSU-0021-5'（10?M） 2.5?l nu-SSU-1780-3'（10?M） 2.5?l Taq DNA聚合酶（5U/?l） 0.3?l 模板DNA 2?l 灭菌双蒸水 29.7?l *10×扩增缓冲液：
Tris-HCl 100mM（PH8.3） KCl 500mM MgCl2 20mM Gelatin 0.01%
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