2.谷氨酸生产菌特性及原因
原因：
1)棒状杆菌属，短杆菌属、小短杆菌属和节杆菌 2)革兰阳性：球、棒状、短杆型，无芽孢，无鞭毛
3)三羧酸循环、戊糖磷酸途径突变，耐高浓度谷氨酸并向胞外分泌。生物素缺陷型，
4）有苹果酸和丙酮酸羧化酶 5α-酮戊二酸脱氢酶活性弱，异柠檬酸脱氢酶活性强，异柠檬酸裂解酶活性弱。 6）谷氨酸脱氢酶活性高，经呼吸链氧化NADPH2的能力弱 7）菌体本身利用谷氨酸的能力低 3.生物素在谷氨酸发酵过程中的作用
影响细胞膜通透性和代谢途径。作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰COA的辅酶，参与脂肪酸的生物合成，进而影响磷脂的合成。浓度过大: 促进菌体生长，谷氨酸产量低。因为:乙醛酸循环活跃， a-酮戊二酸生成量减少，转氨酶活力增强，谷氨酸转变成其他氨基酸。
第13章
1.比较分析现行维生素C的两种生产工艺过程及其本质区别，有什么优劣？
从L-山梨糖至2-酮基-L-古龙酸的步骤不同，以生物氧化取代化学氧化，工艺简洁，省去了丙酮化反应和化学氧化反应，节约丙酮、硫酸、高锰酸钾、氢氧化钠等原料试剂，防爆设备，三废和污染小，提高了生产能力。 2. 维生素C生产工艺中手性中心是如何实现的？
3. 未来一步发酵能取代两步发酵法，成为主流工艺吗，为什么？
不能
第14-1章
1.分析比较基因工程大肠杆菌和酵母表达系统制药的优缺点，如何选择应用？
大肠杆菌系统：缺点 1）缺乏翻译后修饰，如糖基化2）常形成包涵体，复性效果差3）蛋白质易被降解4） 内毒素难以除尽，产生热源5）N端增加的蛋氨酸容易引起免疫反应
优点 1）简单,经济,快速 2）适合于制备抗体,供下游研究
酵母表达系统：载体—安全、无毒，营养缺陷选择外来质粒，培养条件简单，大规模培养技术成熟，亚细胞器分化，进行蛋白质的翻译后正确修饰和加工，并具有良好的蛋白质分泌能力。缺点：酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵，修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用
第14-2章
（1）什么是基因工程菌，工程菌构建的基本过程和各阶段的主要任务是什么，所涉及基因工程原理是什么？
基本过程：（目标基因克隆）PCR、文库，化学合成——（表达载体构建）酶切、连接——（遗传转化与筛选）外源基因导入与培养——（工程菌）新性状、功能、物质 （2）目标基因克隆的主要方法有哪些？分析其特点及其适用范围。 方法 优点 缺点 PCR扩增 简单快速高效，数kb，单基因克隆 DNA聚合酶活性和保真性限制 文库筛选 长片段，无碱基错误，未知序列基因克隆 繁琐，过程复杂，耗时，昂贵 化学合成 简便准确，已知序列，引物合成 受合成仪性能限制，长度很短 （3）大肠杆菌中高效表达蛋白药物着重设计哪几个方面？ （4）为了确保工程菌构建的有效性，必须遵循GMP及其有关生物制品研究技术指导原则，做好菌种的记录和管理。（1）表达载体，详细记录表达载体，包括基因的来源、克隆和鉴定，表达载体的构建、结构和遗传特性。（2）宿主细胞:详细记录宿主细胞的资料，包括细胞株系名称、来源、传代历史、鉴定结果及基本生物学特性等。（3）目标基因序列:目标基因的序列包括插入基因和表达载体两端控制区的核苷酸序列，以及所有与表达有关的序列，做到序列清楚。
第14-3章
1. 工程菌与宿主菌对培养基要求有何不同，为什么？
选择剂:基因工程大肠杆菌含有抗生素抗性基因，抗生素作为选择剂,基因工程酵母菌常用氨基酸营养缺陷型。
2.影响工程菌培养工艺的主要参数是什么？如何优化控制？
1）温度：生长与生产温度不一致。较高温度表达量大，易形成包涵体。 策略：较低温度下有利于表达可溶性蛋白质。
对于热敏感的蛋白质，高温会降解破坏。策略：生产期可采用先高温，然后低温，变温表达，避免蛋白质降解。
2）pH：了解发酵过程中各个阶段的适宜pH以后，进一步设法控制pH在合适的范围内。 分阶段控制pH：根据试验结果来确定生长最适pH和产物最适pH，以达到最佳生产。
3） 溶解氧：从供应量和需要量（菌体生长、质粒稳定性、产物积累）二个方面考虑，使之需氧不超过设备的供氧能力，在临界溶解氧浓度之上。
3诱导物对生长和产物合成有何影响，为什么？
诱导物:诱导表达型工程菌：在细胞生长到一定阶段，必需添加诱导物，以解除目标基因的抑制状态，活化基因，进行转录和翻译，生成产物。
（自己补充：操纵子的开启与关闭均受到环境因子的诱导，这种因子能与调控蛋白结合，改变调控蛋白的空间构象，从而改变其对基因转录的影响，因此也称这种因子为效应物，凡能诱导操纵子开启的效应物称为诱导物）
第15章
1、重组人干扰素生产工艺路线有哪几条，有何优缺点？
1.体外诱生干扰素制备工艺： Sendai病毒诱导人白细胞
缺点： 产量低：1g IFNα，需要 3亿ml人血白细胞。来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵 潜在的血源性病毒污染的可能性 2.人源转化细胞系培养生产工艺
优点：首次用细胞培养8000L，首次实现大规模商业化生产。 缺点：活性低，退出临床应用。 3.基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:
表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体
工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。 4.动物无限细胞系培养生产工艺：
2、重组人干扰素发酵工段的关键控制点是什么，如何实现最优化过程控制？
工艺特点：分泌表达，产量低，成本高,过程控制严格
关键控制点
（1）溶解氧
? 基因工程假单胞杆菌的生长需求15%的溶解氧， 但70%以上的溶解氧才能保证菌体中干扰素α2b的大量合成，其产量是15%溶解氧的6倍， 而菌体生长速率未发生明显变化，质粒稳定性 也有很大的提高。
? 采用两段培养的策略，分别在生长阶段 （30%DO）和生产阶段（60%DO）采用各自最佳溶解氧浓度，以提高干扰素的发酵水平。
基因工程假单胞杆菌的生长最适温度与产物形成的最适温度是不同的。 ? 最佳生长温度则为30℃，发酵温度控制在 20℃可以有效防止干扰素-α2b的降解。
? 质粒的稳定性随温度的升高而迅速下降
? 培养后期降温是提高目标产物积累的重要措施。
（4）温度
（5）pH
? pH的变化由工程菌代谢、培养基的组成和发酵条件所决定
? 干扰素-α在低酸性条件下稳定，能耐受pH 2.5的酸性环境
? 在发酵后期降低pH，使大量蛋白酶失活，减少干扰素-α的水解，提高干扰素的积累量。
? 前期pH7.0，后期pH6.0
3、干扰素纯化工艺的原理是什么？
4、干扰素纯化工艺过程中各工段的目的是什么？
蛋白质纯化的总目标是增加制品纯度或比活性，即增加单位蛋白质质量中目标蛋白质的含量或生物活性。
１）等电点沉淀（为色谱等精致纯化手段减轻压力，起到辅助作用）２）膜分离（3）疏水色谱：降低洗脱液的电导性，使蛋白质的疏水性降低，目标蛋白质就从树脂上被洗脱下来。 ４）离子交换色谱：不同类型的蛋白质与树脂的亲和力不同，可用梯度增加洗脱液中NaCl浓度的方法将其逐一洗脱出来。（5）凝胶过滤色谱：分子筛６）无菌灌装 5、根据干扰素的理化和生物学特性，设计纯 化工艺路线？
第18章 红细胞生成素
（1）比较各种表达系统生产rhEPO的优缺点。
（1）SV40病毒启动子的表达载体，在COS-1中瞬时表达hEPO。
（2）昆虫SF9细胞中杆状病毒载体表达rhEPO。产率有所改善，糖基化程度较小。 （3）家蚕系统表达，糖基化简单，药物在体内稳定性较低、活性较差等问题。 （4）大肠杆菌表达，仅具体外抗原结合活性。
（5）干扰素-α基因启动子的rhEPO表达载体，BALL-1细胞，产生较高量的rhEPO。 （6）CHO、BHK细胞中稳定表达，rhEPO与天然EPO结构、活性相似。
现在工业生产中采用动物细胞培养表达系统，对重组人红细胞生成素进行大规模生产。
（2）CHO培养生产rhEPO的基本工艺过程及其控制点是什么，为什么？
1.种子细胞制备 （1）复苏：液氮冻存的CHO细胞系在37℃中水浴快速融化。无菌离心，弃上清。 （2）培养：加适量DMEM（10%小牛血清），37℃、CO2培养箱培养，连续传三代。 （3）消化：用胰蛋白酶消化贴壁细胞后，制成细胞浓度约为2.5×106个/ml。用于接种。
2．连续培养工艺过程 （1）反应器灭菌（2）接种（3）贴壁培养（4）扩增培养（5）灌流培养（6）收获培养物
3、培养工艺过程控制 (1)搅拌控制：接种后,搅拌速度缓慢，使细胞贴附于载体上，随着细胞数量的增加逐渐提高搅拌速度。
(2)温度控制：较为严格，恒定37℃
(3)pH值控制：7.2-7.4,输入CO2和碳酸氢盐溶液维持其恒定。
(4)溶解氧控制：在50-80％的范围内，通入氧气、空气、氢气或氮气的比例混合气体。 (5)葡萄糖控制：流加补料
(6)代谢废物控制：监测铵、乳酸盐类等，维持较低浓度，减少对细胞损害。
（3）rhEPO分离纯化工艺中使用了哪些操作单元，为什么？
1．初级分离
收获培养液：离心；过滤：滤膜
CM-Sepharose亲和色谱：20mM NaCl-Tris平衡，0-1M NaCl-Tris梯度洗脱，收集活性洗脱峰
透析：0.1mM Tris，过夜，换液4次。 过滤：0.22 μm滤膜。 2．纯化精制
DEAE离子交换：0-1M NaCl-Tris梯度洗脱，收集活性峰。 RP-HPLC：10-70%乙腈洗脱，收集活性洗脱峰。 凝胶过滤：柠檬酸盐缓冲液洗脱，收集活性峰 过滤：0.22 μm滤膜。 3、EPO的质控与活性检测 纯度，蛋白质含量，分子量等
体外活性：ELISA测定（免疫沉淀），单位（IU）
体内活性：网织红细胞计数法，注射BALB/c小鼠，眼眶取血，染色，涂片计数网织红细胞数。
比活性(specific activity, IU/mg)：单位重量蛋白质(mg) 中所含的活性 进一步制成相应的剂型。
按照药典规定及其测定的标准进行。
第24章 三废
1、简述制药企业清洁生产的途径。
(1)资源综合利用——原料资源、水资源、二次资源、废物综合利用；
(2)改革工艺和装备——原料处理工艺的改革、产品制造工艺的全过程统筹、装备技术的更新；
(3) 改进操作和加强管理； (4) 必要的末端处理。
2、简述制药工业的末端污染特点。
制药厂排出的污染物通常具有毒性、刺激性和腐蚀性
化学制药厂的污染物还具有数量少、组分多、变化大、间歇排放、pH不稳定、COD高等特点
这些特点与防治措施的选择有直接关系