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? 芽孢杆菌开始形成芽孢时：产酸菌株开始产生2-酮基L -古龙酸，
直到完全形成芽孢后和出现游离芽孢时，产酸达高峰。
? 方法：显微镜检查。游离芽胞及残存芽孢杆菌菌体已逐步自溶成
碎片，已无法区分两种细菌细胞的差别，整个产酸反应就结束了。 5） 2-酮基L -古龙酸的分离纯化
2-酮基L -古龙酸含量8%左右，残留菌丝体、蛋白质和悬浮的固体颗粒等杂质。
发酵液预处理：静置沉降，菌体蛋白质沉淀。
上清液一次阳离子交换，控制流出液的pH值：收集流出液和洗脱液，调节pH至等电点，加热70℃，加入活性碳，升温90-95 ℃维持10-15min，速冷，过滤。
二次阳离子交换：控制流出液pH1.5-1.7,酸化为2-酮基-L -古龙酸
在45℃下减压浓缩，冷却结晶，离心分离，冰乙醇洗涤，得到2-酮基-L古龙酸，提取率80%以上。
四、维生素C的制备
1.原理： 2-酮基L -古龙酸C4位内酯化、C2位烯醇化得到维生素C。 2.策略：酸或碱催化剂作用下实现。
1）酸转化工艺（被淘汰）
设备简单，流程短，但维生素C破坏严重，质量差。设备腐蚀严重，三废问题没有解决。
2）碱转化：目前的生产方法
? 甲酯化：在无水甲醇中用浓硫酸催化生成2-酮基L 古龙酸甲
酯。
? 内酯化成盐：加NaHCO3转化生成维生素C钠盐，离心分离。 ? 酸化脱色：经氢型离子交换树脂酸化。 ? 在50-55℃下减压烘干，得到粗品维生素C.
? 碱转化工艺流程较长，投资较大，设备腐蚀少， 质量较好。
3）维生素C的精制
第十四章 基因工程制药工艺
基因工程菌：
以微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的表达外源基因，或过量表达或抑制自身基因的工程生物体。 种类：
基因工程大肠杆菌和酵母：重组蛋白质药物；
基因工程技术改造出发菌：氨基酸、抗生素、载体激素、中间体生产。
14.1 基因工程制药微生物表达系统
14.1.1 大肠杆菌表达系统
1、大肠杆菌（Eschericlia coli）形态特征
细胞：G－，单细胞，杆状。鞭毛，无芽孢，一般无荚膜。裂殖。 菌落:白色至黄白色，光滑，直径2－3mm。 2、生化与遗传特性
能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无机盐的极限培养基上生长，发酵糖，产气产酸。
基因工程中使用菌株：K－12株的衍生菌株。基因组：4.6 Mb，3000多种蛋白质。染色体DNA为环状双链，核外遗传物质为质粒。 3、产物表达形式
不溶性蛋白质：细胞质内形成包涵体 可溶性蛋白质：存在于细胞质
周质表达: 外源蛋白被运输分泌到周质，可溶性。 胞外表达：胞内可溶性蛋白质分泌到培养液中。 4、优点和不足
发展最早、应用最广泛的经典的表达系统。
遗传背景清楚、目标基因表达水平高（达70％），培养周期短，抗污染能力强。 不能用于加工修饰化（糖基化、酰胺化）蛋白表达。
细胞死亡后，细胞壁脂多糖游离出来，形成内毒素，具有抗原性，产生热源。 N端增加的蛋氨酸容易引起免疫反应。 14.1.2 酵母表达系统 1、形态特征
细胞：单细胞真核生物，球形、椭圆形、卵形。 繁殖：芽殖、裂殖。在特定条件下才产生子囊孢子。 菌落：乳白色，有光泽，边沿整齐。 2、生长与遗传特征
两个性别不同的单倍体细胞结合形成二倍体接合子。能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖等。生长繁殖迅速，倍增期约2h。酿酒酵母有17条染色体。1996年完成其全基因组测序，遗传背景相对清楚。 3、优点与不足
载体安全、无毒。营养缺陷选择外来质粒。培养条件简单、大规模培养技术成熟。 亚细胞器分化，进行蛋白质的翻译后正确修饰和加工，并具有良好的蛋白质分泌能力。
缺点：酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵。修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用。
14.2 基因工程大肠杆菌的构建技术
14.2.1 构建流程
14.2.2 目标基因的克隆策略
一、概述
?目标基因：是编码蛋白质或多肽的DNA序列。
?正确克隆的重要性: 只要有一个碱基发生（错义、无义、移码）突变，就导致编码氨基酸的变化，影响产物蛋白质的功能和生物学活性。只要一个碱基发生同义突变，就可能导致生产过程和效率变化。
?核酸的一级化学结构：有头——5’磷酸端，有尾——3’羟基，骨架——戊糖，连接的键——磷酸二酯键
?基因克隆方法的选择 方法 优点 缺点 PCR扩增 简单快速高效，数kb单基因克隆 DNA聚合酶活性和保真性限制 文库筛选 长片段，无碱基错误，未知序列基因克隆 繁琐，过程复杂，耗时，昂贵 化学合成 简便准确，已知序列，引物合成 受合成仪性能限制，长度很短 ?RT-PCR克隆目标基因流程
反转录:起始材料RNA PCR ：起始材料DNA
?反转录反应的操作
? 样品变性：75℃水浴5 min，冰冷，引物与mRNA配对。 ? 反转录：反转录酶42℃或37℃，cDNA第1链，1 h。 ? 终止反应：使反转录酶失活，95℃加热5 min。
? 反转录酶：RNA依赖的DNA聚合酶，以RNA为模板， dNTP为底物，
以DNA为引物，合成与RNA互补的 DNA。
? AMV：在42℃下反应，合成片段较短； MMLV：在37℃下反应，合
成片段较长。
? 注意事项：工作环境洁净度，防止RNase的污染。 所用水及相关试剂
必须用DEPC处理，除去RNase。
二、PCR扩增
（1）PCR技术
PCR (Polymerase chain reaction, PCR)： 聚合酶链式反应：在引物指导下，以DNA为模板，由DNA聚合酶催化的扩增特定DNA序列聚合延伸形成互补序列的反应。
本质：生物体的DNA复制原理在体外合成基因。
发明者：Mullis，生物技术革命性象征，1993年 获得诺贝尔化学奖。
（2）PCR单反应原理与过程
（3）PCR扩增的反应体系组成