? 搅拌强度明显影响质粒丢失速率，质粒稳定性都随搅拌强度提高而下
降，温和的搅拌速率适于保持质粒的稳定性。
? pH
? Ph对发酵的影响
? 细菌喜欢偏碱性：大肠杆菌适宜pH为6.5～7.5， ? 真菌喜欢微酸性：酵母适宜pH为5.0～6.0。 ? 影响产物稳定性，最适生长和最适生产pH不同。
? 干扰素是在酸性条件下稳定，而在碱性条件下容易降解。酸性环境有
利于发挥菌株生产能力。 (干扰素:一类糖蛋白，高度种属特异性。抗病毒、抑制细胞增殖、调节免疫、抗肿瘤)
? 乙酸的产生使菌体生长速率下降，也抑制基因表达。 ? Ph对质粒稳定性的影响
? 干扰素在酸性条件下稳定，而在碱性条件 下容易降解。酸性环境有利
于发挥工程菌 株生产能力。
? 酵母生产重组表达乙肝表面抗原的质粒在 pH6时最稳定， 在pH5时
质粒最不稳定。
? pH值控制
? 研究发酵过程中各个阶段的适宜pH，通过流加、补料、搅拌等措施，
设法控制 pH在合适的范围内。
? 分阶段控制pH：根据试验结果来确定生长最适pH和产物最适pH，以
达到最佳生产。
? 连续操作对质粒稳定性的影响
? 连续无选择压力培养，质粒稳定性随稀释速率的增加而降低，如果再加入
选择剂，又可提高质粒的稳定性。
? 在恒化器中无选择剂下培养时，开始一段时间质粒丢失很快，然后就维持
一定水平。
? 流加操作对工程菌质粒稳定性的影响
? 定期分批流加时质粒稳定性比间歇培养和恒化器培 养高。随着培养时间延
长，质粒稳定性下降。
? 适宜的流加方式有利于提高质粒在非选择性培养基 中的稳定性。携有质粒
的细胞在对数生长期减少， 在静止期又增加，在底物耗尽时，无质粒细胞死亡 也较快。
? 改恒速流加为变速流加，能提高非选择条件下质粒 稳定性。 ? 固定化对质粒稳定性的影响
? 与游离悬浮培养相比，固定化后，大大提高并维持质粒稳定性和拷贝数，
在非选择性条件下培养时。
? 以一定比例的质粒细胞和无质粒细胞固定化后，繁殖80代，其在胶粒中的
比例仍保持不变，这与游离 培养完全不同。
? 在搅拌罐和气升式发酵罐中，游离悬浮培养重组酵母质粒不稳定，但固定
化连续操作条件下，能较长时间保持较高的质粒稳定性。 ? 连续操作，固定化提供一种很有吸引力的生产技术
14.3.3 产物诱导表达与终点控制
? 概述
? 一般情况下，目标产物对宿主是不利的
? 常用策略：诱导表达
? 根据启动子类型和目标产物表达的调控模式而定 ? 当产率最大时，结束发酵 ? 在生产中应严格控制
? 适宜的诱导时间：非常重要 ? 诱导物的浓度及其发酵温度： ? 影响表达量，产物存在形式 ? 化学诱导表达
? 化学诱导型启动子： lac 、 tac 、 gal 等
? T7启动子：受T7 RNA聚合酶高度调控的，比大肠杆菌RNA聚合酶高
数倍。
? 诱导时间：对数生长期
? ?工程细菌：IPTG/乳糖诱导 ?工程酵母：半乳糖诱导
? 温度诱导表达
? 温度诱导型启动子： P L、 P R启动子
? 受温度敏感型阻遏物 c I ts 857调控，低温（30℃） 下阻遏物有活性，
抑制转录，高温（42℃）下阻遏物失活，驱动转录。
? 优点是温度诱导，成本低,对宿主菌有毒性产物的表达非常有利。缺点
是产物容易聚集形成包涵体。
? 两段培养发酵：菌体生长对数期或稍后，升高温度，合成产物。
第十五章 重组人干扰素生产工艺
15.1 干扰素概述
一、干扰素的种类
? 概念：机体受到病毒感染时，免疫细胞产生的一组结构类似、功能接近的细胞因子。 ? 细胞因子:由机体细胞合成分泌的能调节生理功能、 参与免疫应答和介导炎症反应
等小分子可溶性蛋白[与免疫球蛋白区别]。 ? 分类
? 具有种属特异性： 人干扰素、牛干扰素 ? 天然人干扰素分类（根据抗原特异性）
? I型干扰素，II型干扰素，III型干扰素
? 氨基酸序列差异分不同亚型：IFNα2a、α2b、α1b ? 基因工程干扰素a与天然干扰素a的序列区别？ 不会 二、干扰素的临床应用
? 广谱抗病毒活性 ? 直接抗肿瘤活性 ? 免疫调节活性 ? 多发性硬化症 三、干扰素的生产工艺路线
1.体外诱生干扰素制备工艺： Sendai病毒诱导人白细胞
缺点： 产量低：1g IFNα，需要 3亿ml人血白细胞。来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵 潜在的血源性病毒污染的可能性 2. 人源转化细胞系培养生产工艺
优点：首次用细胞培养8000L，首次实现大规模商业化生产。 缺点：活性低，退出临床应用。 3. 基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:
表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体 工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。 4. 动物无限细胞系培养生产工艺：
工艺特点：分泌表达，产量低，成本高,过程控制严格
15.2基因工程假单胞杆菌的构建与保藏
1、基因工程假单胞杆菌菌种建立
第一步：人干扰素α-2b基因的克隆 第二步：表达载体的构建 第三步：工程菌的构建
2、基因工程假单胞杆菌菌种特性
i. 具有宿主菌的特征：
细菌：革兰氏阴性菌，有荚膜，无芽孢，杆状。 菌落：直径2.5-3.0 mm，灰绿色半透明,粘稠。 生化特性:缬氨酸、精氨酸和苏氨酸为碳源。 ii. 工程菌的特征： Ser-， StrR、TetR、AmpR iii. 具有生产干扰素能力：
放射性免疫学效价不低于2.0×109IU/L。
3、菌种库的建立与保藏
15.3干扰素的发酵工艺过程
1．摇瓶培养
目的:种子活化与菌种性能恢复 ? 取保存工作种子批菌种，室温融化
? 摇瓶培养：30℃，pH7.0，250 r/min， 18±2h ? 检测：OD值和发酵液杂菌检查。
2．种子罐培养
目的:种子放大，获得足量发酵用优质种子 ?接种：接入50L种子罐，接种量10%。 ?培养：30℃，pH7.0。
?控制：级联调节通气量和搅拌转速 ? DO为30%，3～4h，OD>4.0。 ?检测：显微镜和LB培养基划线检查，控制杂菌。
3．发酵罐培养
?接种：通入300L培养基的发酵罐，接种量10%。 ?控制：级联调节通气量和搅拌转速。 ?前4h：30℃，pH7.0，DO为30%。
?4h后：20℃，pH6.0，DO为60%，5～6.5h。
?终点控制：OD值达9.0±1.0，5℃冷却水快速降 温至15℃以下。 ?检测：发酵液杂菌检查
4．菌体收集
? 连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min 离心收集。
? 菌体保存：－20℃冰柜，不超过12个月。
? 检测：重组人干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构 一致性、质粒稳定性
5．发酵工艺控制分析
? 发酵中菌体生长与干扰素合成的关系
? 在假单胞杆菌的发酵生产中，菌体在培养1.5 小时分裂速度最快，到3.5小时开始下降。
? 干扰素迅速合成出现在3.5小时之后，在4小时达到最大，然后由于降解而迅速下降。
? 假单胞杆菌的生长和干扰素的生产是半偶联相关状态
6. 关键控制点
（1）溶解氧
? 基因工程假单胞杆菌的生长需求15%的溶解氧， 但70%以上的溶解氧才能保证菌体中干扰素α2b的大量合成，其产量是15%溶解氧的6倍， 而菌体生长速率未发生明显变化，质粒稳定性 也有很大的提高。
? 采用两段培养的策略，分别在生长阶段 （30%DO）和生产阶段（60%DO）采用各自最佳溶解氧浓度，以提高干扰素的发酵水平。
基因工程假单胞杆菌的生长最适温度与产物形成的最适温度是不同的。 ? 最佳生长温度则为30℃，发酵温度控制在 20℃可以有效防止干扰素-α2b的降解。
? 质粒的稳定性随温度的升高而迅速下降
? 培养后期降温是提高目标产物积累的重要措施。
（2）温度
（3）pH
? pH的变化由工程菌代谢、培养基的组成和发酵条件所决定
? 干扰素-α在低酸性条件下稳定，能耐受pH 2.5的酸性环境
? 在发酵后期降低pH，使大量蛋白酶失活，减少干扰素-α的水解，提高干扰素的积累量。
? 前期pH7.0，后期pH6.0
15.4干扰素的分离纯化工艺过程
一、干扰素的分离工艺过程
(1)菌体裂解
? 目的：破碎细胞，释放干扰素，防止降解 ? 裂解缓冲液：纯化水，2℃-10℃（pH7.5）
? 使用保护剂：EDTA（抑蛋白制酶的活性）/PMSF 是丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶的抑制剂，保护干扰素被酶水解。巯基试剂如二硫二乙醇，防止干扰素中的巯基被氧化形成二硫键。
? 破碎－20℃菌体：2厘米
? 搅拌：加裂解缓冲液，低温下操作，2℃-10℃， 2hr ? 裂解方法:在缓冲液中，反复冻融，细胞完全破裂。 (2) 预处理
? 加絮凝剂聚乙烯亚胺: 2℃～10℃，搅拌，对菌体碎片进行絮凝。
? 加凝聚剂醋酸钙溶液: 2℃～10℃,搅拌，对菌体碎片、DNA等进行沉淀。