三、酶切反应
? 概念：在特异位点上催化双链DNA分子的断裂， 产生相应的限制性片段。 ? 酶切反应操作：
? 酶切体系组成：DNA，缓冲液，限制性内切酶。 ? 反应条件：适宜温度(37℃)，1小时以上。 ? 终止反应：加热；加入EDTA，螯合镁离子。 ? 电泳检查：酶切完全性。
四、连接反应
? 概念： DNA 双链上相邻的 3′羟基和 5′磷酸基因共价结合形成3′-5′
磷酸二酯键，使原来断开的DNA缺口重新连接起来。 ? 连接反应操作
? 连接体系：载体片段与基因片段，缓冲液，连接酶。 ? 连接反应：16℃-26℃，数小时,或过夜。 ? 终止反应：在70℃加热10分钟。
五、转化
? 转化：把外源基因导入宿主细胞的过程。 ? 大肠杆菌转化——CaCl2法
感受态细胞制备:E·coli经CaCl2处理（0-5℃），使细胞膜通透性增加，从而具有社区外援DNA的能力。
? 感受态细胞融化：置冰上，缓慢。
? 加入连接反应产物：混匀，置冰上30分钟。 ? 热击：42℃，90秒。 ? 置冰上，1－2分钟。
? 扩增培养：加入LB培养基，37℃，45分钟。 ? 涂平板：含有抗生素的LB固体培养基上。 ? 筛选培养：倒置平板，37℃，出现菌落。
六、筛选与鉴定（转化后的细胞类型 ）
? 非转化子：没有导入外源DNA的非转化宿主细胞 ? 转化子：导入外源DNA的转化细胞 ? 非重组子：仅含有空载体分子的转化子 ? 重组子：含有重组DNA分子的转化子
? 目标重组子：含有连接正确的重组子（目的） ? 非目标重组子：连接不正确的重组子。 （自己补充：
原理：利用载体DNA分子所携带的选择性遗传标记基因筛选重组子。标记基因所对应的遗传表型与受体细胞是互补的，因此在培养基中施加合适的选择压力，可保证重组子显现，非重组子不现）
（1）筛选策略及方法
? 抗生素筛选法：基于载体的抗生素抗性基因，氨苄青霉素(即施加的筛选压 力)。只能筛选质粒，不能筛选是否连接成功。 ? Bla基因编码的产物b-内酰胺酶(可以将氨苄结构中的四元内酰胺环
β-内酰胺（β-lactam）水解，使其失去药性)分泌到培养基水解。 ? 在抗性大菌落的周围形成小卫星菌落，为什么?
? 阳性克隆分泌了β-内酰胺酶，并在其周围积累聚集，降解了这
个区域的抗生素，因此没有此质粒的小菌群则环绕而生。
? 第二是质粒丢失。细菌在传代的时候，会出现质粒丢失，传代次
数越多，质粒丢失的可能性越大。对于其他抗生素如氯霉素，细菌如果丢失了部分带抗性的质粒，该菌在含有氯霉素的培养基中是不会生长的。但是对于氨苄则不然，在液体培养液中，培养时间过长的培养基中抗生素的浓度会降低，丢失了一部分质粒的细菌也可以在其中生长。
? 蓝白斑筛选法-α互补原理：
? 质粒lacZ标记基因，编码产物：β-半乳糖苷酶N端 146aa，无活性，
α受体。
? 大肠杆菌染色体DNA：编码C端部分序列，无酶活性， α供体。 ? 受体与供体结合，恢复β-半乳糖苷酶的活性 ? 将无色X-gal底物水解成蓝色产物。
有外源基因，白色菌落； 无外源基因：蓝色 （2）鉴定方法
?菌落PCR：含有目标基因 ?载体大小：电泳检测
?酶切鉴定：目标基因插入及插入方向
?测序确证：目标基因的序列准确无误， 阅读框架通读
14.2.3 表达载体构建
重点介绍表达载体的设计；构建过程和技术同目标基因克隆 一、表达载体的设计
? 表达载体概念：在质粒载体的基础上，在多克隆位点处插入外源基因表达
盒所构成。
? 外源基因表达盒(操纵子模型)： 启动子+目标基因+终止子 ? 大肠杆菌 lac 启动子（不懂）
? 结构
? 受cAMP激活蛋白（CAP）的正调控和lacI负调控 ? CAP-cAMP复合物与操纵基因结合：开启基因转录 ? 四聚体lacI与操纵基因结合：阻止转录起始 ? lac 操纵子的诱导物：IPTG等乳糖类似物
? IPTG与lacI结合，解除lacI的阻遏作用，激活基因转录。
?
? 特点
? 功能：启动子与RNA聚合酶结合，起始基因转录 ? 是最关键的元件：决定着表达的类型和产量。
? 序列特点：－35位，TTGACA序列； －10位，TATAAT序列； 强
启动子:UP元件。
终止密码设计
14.2.4 工程菌构建
? 过程：适宜宿主菌的转化，筛选鉴定，遗传稳定性等。
? 目标：获得质粒能稳定遗传、基因能高效和定向表达的载体，确保药物的
生物活性。
? 表达筛选与产物鉴定
? 不同菌种的表达筛选
? 诱导表达时间和诱导强度的筛选 ? 产物存在形式和存在场所的鉴定
?胞外，周质，胞内；包涵体，可溶性蛋白 ? 表达产物结构与活性鉴定
?电泳，SDS－PAGE，等电点电泳 ?免疫杂交，末端测序，质谱分析 ?分析与目标产物的同一性 1、不同菌株的表达能力不同
同一菌种的不同转化细胞之间存在表达差异。 对宿主菌必需进行筛选 目的：获得最大表达量的菌种。
对转化细胞的对数期进行诱导， 收集菌体，裂解，提取总蛋白 质，进行SDS-PAGE电泳
2、不同诱导时间下的表达
在不同诱导时间， 取样，电泳。随着诱导时间的延长，表达量增加 3、蛋白质存在形式分析
大肠杆菌M109结果：在上清中，可 溶性蛋白质，可溶性表达 大肠杆菌DH5α 结果：蛋白质存在于沉淀中，以包涵体形式表达
14.3 基因工程菌的发酵培养与控制
14.3.1 培养基组成与控制
? ? ? ?
营养与环境作用：碳源，氮源，无机盐， 生长因子 工艺作用：消沫剂
筛选与表达：选择剂，诱导物 大肠杆菌常用培养基：
? LB培养基： 10g/L蛋白胨，5g/L 酵母粉， 10g/L NaCl,pH 7.0 ? M9（无机盐极限培养基）+葡萄糖/甘油,pH 7.0
? 酵母:YPD，10g/L酵母提取物，20 g/L蛋白 胨， 20g/L葡萄糖 ? 选择培养基：氨基酸缺陷的极限培养基+葡萄糖/半乳糖 ? 1、碳源
? 大肠杆菌：葡萄糖, 蛋白胨等蛋白质的降解物 ? 酵母：利用葡萄糖、半乳糖等单糖类物质。
? 随着人类对生物质纤维素水解液利用能力的加强，木糖将作为碳源被开发
?
?
?
?
? 甘油也作为碳源被研究和开发
? 葡萄糖优先利用会造成培养基的酸化。 2、氮源
－＋
? 直接很好地吸收利用铵盐等，硝态氮利用能力差, 缺乏NO3转化成NH4
酶体系。能利用有机氮源。
? 不同工程菌对氮源利用能力差异很大，具有很高的选择性。有机氮源的利
用程度与细胞是否产生分泌相应的降解酶有关，分泌大量的蛋白酶，降解蛋白胨等，然后吸收利用。
? 大肠杆菌：利用大分子有机氮源，酵母粉等。 ? 酵母：酵母粉，蛋白胨，氨基酸为氮源。 3、无机盐
? 磷、硫、钾、钙、镁、钠等大量元素和铁、 铜、锌、锰、钼等微量元素的
盐离子形态
? 基因工程菌生长提供必需的矿物质。
? 在极限培养基中，有时添加不同的维生素， 满足工程菌的生长和生产。 4、选择剂
? 维持工程菌的纯正性和质粒的稳定性的化合物。
? 发酵培养过程中质粒易丢失，使之成为宿主菌；为了保证质粒的稳定性，
不丢失，根据质粒的标记基因，添加或缺陷选择剂。 ? 选择剂种类
? 工程大肠杆菌：具有抗生素抗性；抗生素作为选择剂；卡那霉素、氨
苄青霉素、氯霉 素、博来霉素等
? 工程酵母菌：是氨基酸营养缺陷型，营养缺陷互补筛选；缺陷亮氨酸、
组氨酸、赖氨酸、色氨酸等。
? 培养基质对质粒稳定性的影响
? 复合培养基营养较丰富，质粒稳定性一般高于合成培养基培养。培养
基中添加酵母提取物和谷氨酸等有利于提高质粒稳定性。
? 限制性基质对工程菌的比生长速率有不同影响，低比生长速率较高比
生长速率更易丢失质粒。
? 大肠杆菌对葡萄糖和磷酸盐限制易发生质粒不稳定。
? 酵母在极限培养基比丰富培养基更有利于维持质粒稳定性。 5、诱导物
? 诱导表达型工程菌：在细胞生长到一定阶段， 必需添加诱导物，以解除目
标基因的抑制状态，活化基因，进行转录和翻译，生成产物。 ? 诱导物成为产物表达必不可少的。
? Lac 启动子表达系统：IPTG/乳糖诱导。
? 工程酵母：gal启动子，加入半乳糖进行诱导。
14.3.2 培养工艺与控制
目的:提供生长和产物合成的适宜条件,使菌种发挥最大的遗传潜力 考虑工艺条件对工程菌生长、产物生物合成及质粒稳定性的影响 ? 质粒的不稳定性与控制策略
? 工程菌的质粒不稳定性
? 质粒复制不稳定性：不正常的起始和终止、延伸时断裂及错配等，产
生单链质粒和高分子量畸型质粒。
? 质粒分配不稳定性：细胞分裂时，质粒也分配，在子代细胞中分配不
均一而导致部分细胞完全丢失质粒。子细胞中质粒拷贝数
? 质粒结构不稳定性：由于缺失、插入、突变或重排等 使质粒DNA的序
列结构发生了变化，引起复制和表达的不稳定性。
? 提高质粒稳定性的策略
? 基因工程菌质粒稳定性受宿主细胞的特性、质粒 的类型和培养条件等
影响，是质粒、宿主菌与培 养环境三者之间相互作用的结果。 ? 对于一定结构质粒，筛选适宜宿主菌，优化培养 条件与工艺，提高稳
定性，对基因工程药物的生 产具有重要的意义。
? 温度
? 温度对工程菌生长的影响
? 符合三基点原则：最低，最适，最高 ? 大肠杆菌和酿酒酵母生长最低温度10℃
? 大肠杆菌生长最适温度37℃，最高温度45℃。 ? 酿酒酵母生长最适温度30℃，最高温度40℃。 ? 温度对工程菌产物合成的影响
? 生长与生产温度不一致。
? 工程大肠杆菌： 较高温度表达量大，易形成包涵体;较低温度下有利
于表达可溶性蛋白质。对于热敏感的蛋白质，高温会降解破坏
? 温度对工程菌质粒稳定性的影响
? 随着温度升高，质粒的稳定性下降。 ? 大肠杆菌在30度左右质粒稳定性好。
? 采用温敏启动子控制的质粒，大肠杆菌由 30度升高到42度诱导外源
基因表达目标产物时，经常伴随质粒的丢失。
? 温度控制
? 两段变温发酵培养： 前期：较高温度发酵，获得足够高的菌体密度；
后期：较低温培养发酵，对菌体合成目标产物的抑制不明显，但可有效抑制目标产物的降解和包涵体形成，总体提高工程菌的生产能力。 ? 温度诱导型大肠杆菌表达系统：可建立基于温度变化的分步连续培养，
在第一个反应器中，30-37℃下生长培养，增加质粒稳定性，然后流入第二个反应器中，在 42℃下诱导表达。 温度的控制相当重要，必须选择适当的诱导时期和适宜的诱导温度。
? 溶解氧
? 溶解氧对发酵的影响
? 工程菌是好氧微生物，生长过程需要大量氧。
? 从供氧量和需氧量（菌体生长、质粒稳定性、产 物积累）二个方面考
虑，使之需氧不超过设备的 供氧能力，在临界溶解氧浓度之上。 ? 考虑高氧浓度对产物的氧化降解作用，低氧或厌 氧导致有机酸生成，
抑制生长。
? 调节搅拌转速和通气量，级联控制 ? 溶解氧对质粒稳定性的影响
? 较低生长速率下质粒稳定,提高氧压力或增加氧浓 度能引起细胞内氧
化性胁迫，稳定阶段缺氧条件引起产物生成和质粒稳定性受限制。