论文
生 命 科 学 研 究 2002年3441 材料和方法1.1 材料1.1.1 培养基
的植酸酶量,用IU表示.2 结果和讨论
2.1 产植酸酶菌株的筛选
筛选培养基(%):植酸钙0.1,葡萄糖3,NH4NO30.5,KCI0.05,MgSO4 7HO20.05,MnSO4 7HO20.003,FeSO4 7HO20.003,琼脂1.8,pH5.7.
由于植酸钙的螯合作用,使培养基形成白色混浊,产植酸酶的菌株则会水解植酸钙,在菌落的周围形成透明圈,根据透明圈的有无和大小,可以初步判断该菌是否产植酸酶及酶活的高低.90余株菌中筛选出41株菌产植酸酶,其中真菌25株,细菌16株.从中选取20株透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株进行液体发酵.测定发酵液酶活,结果表明有13株菌酶活超过10IUΠml,其中,一株黑曲霉AN00101的酶活最高,达到171IUΠ
ml.
此培养基用于筛选真菌,牛肉膏蛋白胨培养基加0.1%的植酸钙用于筛选细菌.
液体发酵培养基:60g麸皮加入到935ml水中,再加入5gNaOH,在121℃处理20min后,用8层纱布过滤.所得滤液加入(1gper100ml):(NH4)2SO40.04、MgSO4 7HO20.02、casitone1、KH2PO40.05、K2HPO40.04,细菌培养基的pH为6.5,真菌培养基的pH为5.7.
固体发酵培养基:麸皮按试验设计加水灭菌即是.1.1.2 试剂
植酸钙Π合液:250ml(100gΠL)+250ml钒酸铵(2.35gΠL)+165ml65%硝酸+335ml水.1.2 方法1.2.1 产植酸酶菌株的初筛
将从土壤分离及本实验室所保藏的共90余株菌点接于筛选培养基上,在30℃培养3d.对有透明圈的进行重复筛选.1.2.2 产植酸酶菌株的复筛挑取产透明圈菌株接种于液体发酵培养基中,30℃摇振培养4d后,6000rΠmin离心20min,得粗酶液,测酶活.1.2.3 产植酸酶菌株的固体发酵
挑取菌株接种于固体发酵培养基中,在30℃培养3～6d,每天翻动一次.采用文献[7]方法抽提,得粗酶液,测酶活.1.2.4 酶活力测定
粗酶液进行适当稀释后,取0.2ml加入0.6mlpH5.50.25molΠL乙酸缓冲液,在37℃保温5min后加入8.4gΠL植酸钠1.6ml,继续保温30min,加入颜色Π终点混合液1.6ml,415nm测定无机磷含量.对照:在0.2ml酶液加入0.6ml乙酸缓冲液后,再加入1.6ml颜色Π终点混合液,最后加入底物.
植酸酶活性单位定义:在37℃pH5.5的条件下,每分钟从底物释放1纳摩尔无机磷所需要
图1 黑曲酶AN00101在含植酸钙平板上形成透明水解圈
Fig.1 ThehydrolysisboundresultbyA.nigerAN01001inplatecontainingcalciumphytase
2.2 产酶条件的研究
固体发酵与液体发酵相比,具有设备较简单、成本低、酶产量高和易于投产等优点,所以产酶条件的研究注重于对固体发酵的研究.2.2.1 培养基最适加水量的确定培养基中水分含量对菌体的生长及酶的产生都有很大影响,水分含量太少不利于菌的生长,太多不利于代谢产物的积累.在250ml三角瓶中装入10g麸皮,再加入不同体积的自来水,使加水量占总质量的30%～70%,每相差5%为一个处理,在30℃培养4d,测酶活.
从图2中可以看出培养基中加水量在35%时,测得的酶活最高,低于35%菌体生长缓慢;高于35%菌体虽生长很好,但测得的酶活较低,加水量为70%的酶活只是35%的酶活24.5%,原因可能是加水量低于35%时,培养基的水活度偏低,菌体延缓期延长,生长缓慢;加水量过多,对数生长期延长,不利于代谢产物积累.这与其它文献