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Research Articles
基础研究
物学国家重点实验室保藏并惠赠；IFN-γ和IL-4 购于美国Perprotech公司；LPS购于美国Sigma公司；小鼠GAPDH，iNOS，CD86，MR和ArgⅠ引物均由北京三博远志生物技术有限责任公司合成；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ购于宝生
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照组△Ct(目的基因Ct-管家基因Ct)-各组△Ct(目的基因-管家基因Ct)。
2.结果
2.1 干预后RAW264.7的细胞形态改变：根据预定干预浓度对RAW264.7进行刺激12h后，电子显微镜下观察细胞的生长状态，发现LPS，IFN-γ以及IL-4的大浓度干预组细胞死亡较多，存活的细胞状态亦较差，与正常培养条件下的细胞相比，细胞形态变小变圆，大多呈现出细胞皱缩，也没有正常的伪足伸出且贴壁能力较弱。而中小剂量刺激组的细胞存活率高，细胞状态较正常培养情况下并无太多改变。（图１）
物工程（大连）有限公司；高糖DMEM培养基购于美国In-vitrogen公司；胎牛血清购于杭州四季青公司；RNA提取试剂盒Fastagen200购于上海飞捷生物技术有限公司；RNA逆转录试剂盒购于美国Fermentas公司；其余试剂均为进口或国产分析纯试剂。
方法
RAW264.7细胞的培养和传代：含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基加入80U/ml氨苄青霉素和100U/ml链霉素后通过0.22μm滤膜过滤除菌，于含5%CO2 的37℃恒温培养箱培养RAW264.7细胞，每隔24h至48h观察细胞状态并换液，必要时以1:2或1:3比例传代，以维持细胞的良好生长状态。
M1/M2亚型的刺激：干预前12h以105个/ml密度铺细胞于12孔板，以1ml完全培养基培养。待细胞完全贴壁且生长状态良好时加入不同浓度的刺激因子。根据不同文献的报道，将三种刺激因子的浓度均分为三个浓度梯度，并进行分组。IFN-γ分为25ng/ml，2.5ng/ml和1ng/ml三个浓度梯度；LPS 分为400ng/ml，200ng/ml和100ng/ml三个浓度梯度；IL-4分为100ng/ml，10ng/ml和1ng/ml三个浓度梯度。12h后观察细胞状态并吸去培养基，冰PBS洗三遍，收集细胞。
RNA的提取和逆转录：将收集的细胞按照RNA提取试剂盒说明书操作，提取的总RNA使用两步法进行逆转录，第一步，12μl体系加入1μl random primer，65℃，5min；第二步，再加入5×buffer 4μl，10nM dNTP 2μl，inhibitor enzyme1μl
中国分子心脏病学杂志 Volume 11 No.2 April 2011
和reverse enzyme 1μl，总体积为20μl，25℃，5min，45℃，60min，70℃,5min进行反应。逆转录完毕收集cDNA，直接进行Realtime PCR或储存于-20℃。
Realtime PCR：采用
SYBRⅡ嵌合荧光法，测量细胞各指标mRNA的表达（基因序列见表1）。反应条件为95℃温育l0s，95℃变性5s，61.5℃退火20 s，72℃延伸12 s，共45个循环，每个反应做3个复孔。内参照采用GAPDH。扩增完毕后进行溶解曲线分析，溶解曲线在产物Tm处表现为单峰，表明扩增特异性良好。因为目的基因与内参基因的扩增效率一致，Realtime定量PCR统计分析采用2-△△Ct法，△△Ct=对
图1 正常条件和不同条件干预12h后的RAW264.7细胞形态N 正常培养条件下的RAW264.7细胞
A（M1-1）400ng/mlLPS+25ng/mlIFN-γB（M1-2）200ng/mlLPS+25ng/mlIFN-γC（M1-3）100ng/mlLPS+25ng/mlIFN-γD（M1-4）400ng/mlLPS+2.5ng/mlIFN-γE（M1-5） 200ng/mlLPS+2.5ng/mlIFN-γF（M1-6）100ng/mlLPS+2.5ng/mlIFN-γG（M1-7） 400ng/mlLPS+1ng/mlIFN-γH （M1-8） 200ng/mlLPS+1ng/mlIFN-γI （M1-9）100ng/mlLPS+1ng/mlIFN-γJ （M2-1）100 ng /ml IL-4K （M2-2） 10 ng /ml IL-4L（M2-3）1 ng /ml IL-4
表1. realtime PCR所用引物序列
目的基因iNOSCD86MRArg IGAPDH
上游引物序列（5’- 3’）
CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGCTCAGTCAGGATGGGAGTGGTACATGAGGCTTCTCTTGCTTCTGCAGAAGAATGGAAGAGTCAGTCAACGGCACAGTCAAGG
下游引物序列（5’- 3’）
CCAAAGCCACGAGGCTCTGACAGCCATCCAAGAGCCATTCCTACCTTTGCCGTCTGAACTGAGATGGGGTGACTCCCTGCATATCTGACTCCACGACATACTCAGC
扩增长度497bp277bp143bp250bp126bp
Genebank IDNM_010927.3NM_019388.3NM_008625.2NM_007482.3NM_008084.2
数据统计与分析：实验所得数据采用均数±标准差表示，组间采用方差分析及t检验，由SPSS15.0统计软件完成，P<0.05为差异有显著性意义。