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生物技术通报 Biotechnology Bulletin
2012年第5期
Dale和Ow［8］首先证明了Cre重组酶介导的删除反应能够成功应用于转基因植物中，删除标记基因。自从Dale等的先驱工作后，通过Cre/lox重组系统已成功获得许多物种的无标记转基因植物，表1列出了部分代表性成果 。
表1 通过Cre/lox
成功获得无标记的转基因植物
Kopertekh等［17］通过一个以马铃薯X病毒（PVX）为基础的载体，实现了Cre重组酶在转入了lox靶位点的烟草中的瞬时表达，重组表达的效率在
［18］
48%-82%之间。Kopertekh等利用农杆菌侵染法，
使Cre重组酶在转基因植株内瞬时表达。
第三种策略通常是用诱导型启动子（如热激诱导启动子或化学诱导启动子）使Cre重组酶在一定条件下表达。Khattri等［12］构建了两个载体，一个载体含有Cre基因和热激启动子Hsp17.5E；另一个载体，两个同向的lox位点之间带有选择标记基因npt，载体还带有一个无启动子的gus基因。用基因枪轰击盾片愈伤组织，从而使两个载体转入水稻中。热激胁迫诱导Cre/lox重组系统后，npt被删除，gus基因可以作为Cre/lox重组系统的便携的遗传标记。
但此方法有背景活性、低的重组效率以及转基因不能被完全删除等问题。为此，研究者们开始将，其组织特异型启动子应用于Cre/lox重组系统［19］优点是：高重组效率、不需要额外的步骤激活Cre重组酶、并且能更高效的将重组状态传给下代。Kopertekh等［9］通过共转化，将lox靶位点和Cre重组酶引入烟草中，依靠种子特异启动子的诱导，使bar基因表达盒从烟草基因组中全部删除。标记基因的删除没有干扰目的基因的表达。
目前主要有3种策略可将Cre重组酶的活性提供给含lox位点的目标植株，进而删除标记基因。第一种策略是利用Cre的组成型表达，对带有标记基因和lox位点的转基因植株进行再转化，使Cre表达载体转入其中，激活重组系统；也可以将带有标记基因和lox位点的转基因植株与能够表达Cre重组酶的植株进行杂交，激活重组系统。这种策略的优点是重组率高，缺点是耗费时间、操作繁琐，并且可能引起转基因植物中基因型和表型的改变。Dale等［8］就是利用此种方法首先证明了Cre重组酶介导的删除反应能够成功应用于转基因植物。2010年，Sengupta等［16］构建了含有ASAL（青叶蝉和褐飞虱抗性）编码序列的载体，此载体上含有两个方向相同的lox位点，lox位点之间带有选择标记基因hpt。同时，构建了另一个含有Cre重组酶基因的载体。转化后，将3株含有单拷贝ASAL-lox-hpt-lox T-DNA区的T0代植株与3株含有单拷贝Cre-bar T-DNA区的T0代植株进行杂交。通过潮霉素筛选试验表明，T1代中标记基因已经被删除。分析表明T1代植株有27.4%的重组效率。
第二种策略是Cre重组酶的瞬时表达，重组效率与第一种策略相当，但此方法需要额外的步骤引入重组酶和筛选重组的细胞，其主要应用于无性繁殖植物。目前主要通过含有Cre载体的病毒和根癌。农杆菌侵染植株，提供Cre重组酶瞬时表达［17, 18］
2.2 产生单拷贝转基因植株
遗传转化过程中，外源基因的多拷贝容易导致
基因失活，使转基因沉默，利用Cre/lox重组系统可以删除转基因中多余的拷贝。Srivastava等［20］首先创造性的使用Cre/lox重组系统，将有4个多拷贝位置的转基因小麦植株完全转变成为单拷贝。随后De Buck等［21］构建了含SB-loxP的T-DNA区，在两个方向相反的loxP位点之间引入了标记基因nptⅡ和gus基因。这样，无论插入的T-DNA区的数量和方向如何，发生在最外面的loxP位点之间的重组会将多余的拷贝删除，产生单一的T-DNA区拷贝。将带有多个SB-loxP序列的7个转基因植株与能产生Cre重组酶的植株进行杂交，有3个杂交后代是单拷贝插入的。但是，此种构建方法，即将两个方向相反的lox位点构建在一个T-DNA区上，容易使两个lox位点间的DNA片段倒转。De Paepe等［22］运用此种