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生物技术通报 Biotechnology Bulletin
2012年第5期
a. 目标基因组内Cre的稳定表达；b. Cre的瞬时表达
图3 Cre/lox重组系统的共整合［28
］
3.2 突变型 lox 位点的使用策略
其结构原理，如图5所示。
这个策略的重要组成部分是突变型lox位点的
使用。因为两个loxP之间的重组反应很容易可逆，这样两个loxP位点之间的整合反应往往不稳定。因此，为了稳定整合位点，研究者们构建了突变的lox位点，当loxP位点的左侧或右侧的两个反向重复序列内的4-7个碱基发生改变时，便产生了突变型lox位点。例如，左侧突变位点lox76和右侧突变位点lox75，它们是loxP的左侧和右侧序列分别有7个碱基发生了改变，当lox76与lox75发生重组反应时，就会产生一个野生型loxP位点和一个双突变lox位点［28］。双突变位点与lox75、lox76及loxP位点相比，反应活性会低很多，从而使整合更加稳定（图4）。Vega等［29］通过Cre/lox特异位点重组系统，利用loxP的突变体lox66/lox71提高了重组效率，实现了外源基因的定点单拷贝插入。此种策略还能够阻止质粒骨架整合进基因组［30］。对转基因植物来说，转入的质粒骨架是多余的元件，它的存在可能会诱导基因沉默［31］，通过该重组系统可将质粒骨架删除，
图 5 通 过两个lox位点重组产生不含载体骨架的
定点整合［30
］
3.3 RMCE策略
重组酶介导的盒式交换（recombinase-mediated
cassette exchange，RMCE），它主要利用重组酶对异种特异性位点的识别差异，通过两次相对独立的重组反应产生一种交换的效果，其优点是能够确保外源基因整合的高效性、定点可重复性和精确性。RMCE主要包括两种方式：基于Flp/FRT的RMCE和基于Cre/lox的RMCE。以Cre/lox为例，异种特异性lox位点是指在8 bp的间隔区内发生了碱基突变［32］，基于此原则，异种特异性lox位点有以下几对：loxP-lox511、loxP-lox257、loxP-m2、loxP-lox5171、loxP-lox2272等。一般来说，8 bp间隔区内单一碱基对的突变对重组反应效率的影响很小，但对反应的专一性的影响很大。例如，两个不同的间隔区突变体几乎不相容，而同一位点突变体却能发生高效的重组［33］。Cre介导的盒式交换的基本原理，如图6
a. lox位点左侧或右侧(LE or RE)反向重复序列中的4-7个改变的碱基；b. LE突变体与RE突变体重组后形成双突变体
图4 突变型lox位点的共整合［28］