贵阳医学院2014届硕士研究生论文
16 (5)按照下表配制积层胶液，根据表中配方依次加入各溶液，10%APS 和 TEMED 最后加入。
配制不同体积和浓度凝胶所需要各成分的体积/ml
成分 5%
去离子水（Deionized water ） 2.1
30%丙烯酰胺溶液 0.5
1.5 mol/L Tris 溶液（pH6.8） 0.38
10 %十二烷基硫酸钠（SDS ） 0.03
10% 过硫酸铵（APS ） 0.03 TEMED 0.003
(6)30 min 后，将分离胶上面的ddH 2O 倾倒掉，用滤纸吸干板边缘的水。
(7)在配好的积层胶溶液注入胶板中并将梳齿插入积层胶上部（插入的深度根据上样需求决定）。室温放置 20-30 min ，凝固后将胶板放入电泳槽中。
(8)将电泳缓冲液加入槽中（注意尽量平稳加入，减少气泡产生）。
3. 样品制备
(1)根据样品的蛋白浓度,按比例加5³LB 。4℃ 15000 rpm 离心5min ，取上清转移至新的epp 管中。
(2)100 ℃加热 5 min 。
4、 蛋白质电泳
(1)将梳齿从积层胶中拔出(如果加样孔弯曲可用注射针进行调拨)。
(2)样品离心完后，将epp 管按加样顺序排列逐个用移液器和20μl tip 头上样。
(3)连接电极端口（注意连接正负极正确），打开电泳仪电源，设置电泳参数（积层胶电泳 80 mV ，分离胶电泳 120 mV ，总时间 2.5 h ）。电泳过程中应该注意观察条带压缩情况、电泳速度及电压的稳定情况，当条带进入分离胶时注意切换电源。
5、 胶的剥离
(1)当溴酚蓝电泳至胶末端时，停止电泳。
(2)卸下电泳装置，用纯水清洗胶板，剥离尺缓慢撬开玻板（注意不要撬动边角