药物分析实验
实验一 葡萄糖中一般杂质检查（4学时）
【实验目的与要求】
1. 了解药物中一般杂质检查的项目、目的和意义； 2. 理解杂质限量的概念并掌握其计算方法；
3. 掌握氯化物、硫酸盐、铁盐、重金属限量检查的基本原理和操作方法。
【实验原理】
1. 杂质限量：即药物中杂质的最大允许量。
杂质限量=杂质最大允许量?100%
供试品量=标准溶液的浓度?标准溶液的体积?100%
供试品量或 L?C?V?100%
S其中，C为标准溶液浓度，V为标准溶液体积，S为供试品质量，L为杂质限量。 2. 一般杂质的限量检查 （1）氯化物的限量检查
药物中的氯化物与硝酸银在硝酸酸性溶液中作用，生成氯化银微粒而显白色浑浊，同一定量的标准氯化钠溶液与硝酸银在同样条件下，用同法处理生成的氯化银浑浊程度相比较，判断药物中含氯化物的限量。
Cl- + Ag+ → AgCl ↓
（2）硫酸盐的限量检查
药物中微量硫酸盐与氯化钡在酸性溶液中作用，生成硫酸钡微粒而显白色浑浊液，同一定量标准硫酸钾溶液与氯化钡在同样条件下，用同法处理生成的硫酸钡浑浊程度相比较，判断药物中含硫酸盐的限量。
SO42- + Ba2+ → BaSO4 ↓
（3）铁盐的限量检查
药物中的三价铁盐（若含有Fe2+，加硝酸煮沸5分钟，可使Fe2+ 氧化为Fe3+）与硫氰酸盐在硝酸酸性溶液中作用，生成硫氰酸铁配位离子而显红色，与一定量标准铁溶液与硫氰酸盐在相同条件下，用同法处理生成的硫氰酸铁配位离子溶液进行比色，判断药物中含铁盐的限量。
Fe3+ + 6 SCN- → [Fe(SCN)6]3- （红色）
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（4）重金属的限量检查
重金属一般是指能与硫代乙酰胺或硫化钠在弱酸性（pH 3~3.5）溶液中，作用生成硫化物的金属杂质，如铜、银、铅、镉、汞、砷、锑、铋、锡、锌、钴、镍等。重金属不仅影响药物稳定性，而且在体内容易蓄积，造成慢性中毒，因此必须严格控制限量。在药品生产过程中遇到铅的机会较多，铅又易积蓄中毒，故以铅为代表。
由于在弱酸性（pH约3.5）溶液中硫代乙酰胺水解，产生硫化氢，可与重金属离子作用，生成有色硫化物沉淀，与标准重金属溶液在同样条件下，按同法处理后进行比较。
CH3CSNH2 + H2O → CH3CONH2 + H2S ↑
Pb2+ + H2S → PbS ↓ + 2 H+
【实验材料、试剂与仪器】
原料名称 葡萄糖 稀硝酸 标准氯化钠溶液 硝酸银试液 标准硫酸钾溶液 氯化钡溶液 标准铁溶液 硫氰酸铵溶液 标准铅溶液 醋酸盐缓冲液 稀焦糖溶液 硫代乙酰胺试液 规 格 普通市售 10 μg /mL 10 μg Cl-/mL 0.1 mol/L 100 μg SO42-/ mL 25% 0.01% 30% l0 μg Pb/ mL pH 3.5 0.2 g/ mL 0.04 g/ mL 用 量 适量 适量 6 mL 2 mL 2 mL 5 mL 2 mL 3 mL 适量 2 mL 适量 2 mL
50 mL纳氏比色管，过滤装置，移液管，滴定管。
【实验方法与步骤】
1. 氯化物
取葡萄糖若干克（取用量按所提供的药品中杂质的限量计算，g），置50 mL纳氏比色管中，加蒸馏水溶解并配成25 mL (如溶液显碱性，可滴加硝酸使成中性)， 再加稀硝酸10 mL；溶液如不澄清，应滤过；加蒸馏水配成约40 mL，摇匀，即得供试溶液。另取标准氯化钠溶液(10 μg Cl-/ mL) 6.0 mL，置另一50 mL纳氏比色管中，加稀硝酸10 mL，加蒸馏水配成约40 mL，摇匀，即得对照溶液。于供试溶液与对照溶液中，分别加入硝酸银试液1.0 mL，用蒸馏水稀释成50 mL，摇匀，在暗处放置5 min，同置黑色背景上，从比色管上方向下观察、比较，供试溶液不得比对照溶液更浑浊（本品中氯化物限量为0.01%）。 2. 硫酸盐
取葡萄糖若干克（取用量按所提供的药品中杂质的限量计算，g），置50 mL纳氏比色管中，加蒸馏水溶解配成约40 mL (如溶液显碱性，可滴加盐酸使成中性)；如溶液不澄清，应滤过；加稀盐
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酸2 mL，摇匀，即得供试溶液。另取标准硫酸钾溶液(100 μg SO42-/ mL)2.0 mL，置另一50 mL纳氏比色管中，加蒸馏水配成约40 mL，加稀盐酸2 mL，摇匀，即得对照溶液。于供试溶液与对照溶液中，分别加入25%氯化钡溶液5 mL，用蒸馏水稀释配成50 mL，充分摇匀，放置10 min，同置黑色背景上，从比色管上方向下观察、比较，供试溶液不得比对照溶液更浑浊（本品中硫酸盐限量为0.01%）。 3. 铁盐
取葡萄糖若干克（取用量按所提供的药品中杂质的限量计算，g），置烧杯中，加蒸馏水20 mL溶解后，加硝酸3滴，缓缓煮沸5分钟，放冷，转移至50 mL纳氏比色管中，加蒸馏水稀释配成45 mL，摇匀，即得供试溶液。另取标准铁溶液（0.01%）2.0 mL，置另一50 mL纳氏比色管中，加硝酸3滴，加蒸馏水稀释配成45 mL，摇匀，即得对照溶液。于供试溶液与对照溶液中，分别加入硫氰酸铵溶液(30 →100) 3 mL，摇匀，立即同置白纸上，从比色管上方向下观察、比较，供试溶液不得比对照溶液颜色更深（本品中铁盐限量为0.001%）。 4. 重金属
取葡萄糖若干克（取用量按所提供的药品中杂质的限量计算，g），置50 mL纳氏比色管中，加蒸馏水23 mL溶解后，加醋酸盐缓冲液（pH 3.5）2 mL，摇匀，即得供试品溶液。另取标准铅溶液 (l0 μg Pb/ mL) 2 mL（若供试品溶液带颜色，向对照液中滴加少量的稀焦糖溶液或其它无干扰的有色溶液，使之与供试品颜色一致）与醋酸盐缓冲液（pH3.5）2 mL，置另一50 mL纳氏比色管中，加蒸馏水稀释成25 mL，摇匀，即得对照溶液。于供试溶液与对照溶液中，分别加硫代乙酰胺试液各2 mL，摇匀，放置2 min，同置白纸上，从比色管上方向下观察、比较，供试溶液不得比对照溶液颜色更深（含重金属不得超过百万分之五）。
【注意事项】
1. 纳氏比色管的选择与洗涤
比色或比浊操作，一般均在纳氏比色管中进行，因此在选用比色管时，必须注意使样品管与标准管玻璃色质一致（最好不带任何颜色），体积相等，管上的刻度均匀，如有差别不得相差2 mm。
比色管洗涤时避免用毛刷或去污粉等洗刷，以免管壁划痕影响比色或比浊。 2. 比色、比浊时，样品液与标准液的实验条件应尽可能一致，平行操作。
3. 严格按操作步骤进行试验，注意各种试剂的加入次序。如氯化物检查时，加适量蒸馏水配成约40 mL后，再加AgNO3试液。
4. 比色、比浊前应使比色管内试剂充分混匀，主要利用手腕转动360°的旋摇操作来完成。比色方法是将两管同置于白色背景上，从侧面观察；比浊方法是将两管同置于黑色或白色背景上，自上而下观察。
5. 重金属检查中，应注意：
(1)样品管中“加水23 mL溶解后，加醋酸盐缓冲液（pH3.5）2 mL”实验时宜采用“加水适量溶解后，加醋酸盐缓冲液（pH 3.5）2 mL，再加水使成25 mL”，更便于操作。加醋酸盐缓冲溶液前，注意比较样品管与标准管的溶液颜色，若样品管带色，应在对照标准管中滴加少量稀焦糖液，使两
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管的颜色一致，然后依法操作。
如在标准管中滴加稀焦糖溶液仍不能使颜色一致时，可取该药品项下规定的二倍量的供试品和试液，加水配成30 mL，将溶液分成甲乙二等分，乙管中加水稀释成25 mL；甲管中加入硫代乙酰胺试液2 mL，摇匀，放置2 min，经滤膜 (孔径3 μm)滤过，然后甲管中加入标准铅溶液一定量，加水配成25 mL；再分别在乙管中加硫代乙酰胺试液2 mL，甲管中加水2 mL，依法比较，即得。
(2)标准铅溶液应在临用前精密量取标准铅贮备液新鲜配制，以防止铅的水解而造成误差。
【思考题】
1. 药物中一般杂质主要包括哪些？
2. 砷盐的检查方法有哪些？古蔡氏法检查砷盐，能适用于所有的药物吗?为什么？
实验二 盐酸普鲁卡因注射液中特殊杂质的检查（3学时）
【实验目的与要求】
1. 了解盐酸普鲁卡因的结构和性质；
2. 了解盐酸普鲁卡因注射液中的特殊杂质的检查方法； 3. 掌握TLC法测定有关物质的原理与测定方法； 4. 熟悉并掌握薄层板的制备与活化。
【实验原理】
1. 结构与性质
H2NCOOCH2CH2N(C2H5)2 HCl
C13H20N2O2.HCl 272.15
盐酸普鲁卡因化学名为4-氨基苯甲酸-2-(二乙氨基)乙酯盐酸盐，白色结晶或结晶性粉末；无臭，味微苦，随后有麻痹感；在水中易溶，在乙醇中略溶，在氯仿中微溶，在乙醚中几乎不溶；用于局麻。
2. 盐酸普鲁卡因中特殊杂质“对氨基苯甲酸”的来源及检查的必要性
盐酸普鲁卡因分子中含酯键，因此盐酸普鲁卡因注射液在贮藏期间，普鲁卡因可发生水解反应生成对氨基苯甲酸和二乙氨基乙醇：
COOCH2CH2N(C2H5)2+NH2H2ONH2COOH+HOCH2CH2N(C2H5)2
盐酸普鲁卡因注射液在贮存过程中的稳定性与溶液的pH、贮存温度、容器玻璃质量、空气中氧
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以及光线照射等有密切关系。如pH为6的溶液，于37 ℃放置40天后，分解率约为4.3~ 4.6%；pH在4.0~5.0之间的溶液，久贮后仍较稳定。但保存不当，受空气及光线影响，对氨基苯甲酸可脱羧生成苯胺，而苯胺又会被氧化成有色物质使注射液变黄，降低疗效，增加毒性。所以，中国药典2010年版（是ChP2010吗？）中规定盐酸普鲁卡因及其注射液均需要检查对氨基苯甲酸的含量，并且盐酸普鲁卡因注射液中对氨基苯甲酸的限量不得超过标示量的1.2%。 3. 盐酸普鲁卡因注射液中特殊杂质“对氨基苯甲酸”的检查原理和方法
检查对氨基苯甲酸的方法曾采用溶剂抽提后比色法，该法操作麻烦、费时。中国药典1985年版至2005年版则采用薄层色谱法检查之。利用薄层色谱法的高分离效能，将对氨基苯甲酸与盐酸普鲁卡因等物质分离后，喷以对二甲氨基苯甲醛溶液，在冰醋酸存在下与对氨基苯甲酸缩合形成Schiff碱呈有色斑点，并同时与对照品溶液的主斑点进行比较。
H3CH3CNCHO+NH2COOHH+H3CH3CNHCNCOOH
选用实际存在的待检杂质作为对照标准进行药物中特殊杂质检查的方法较为理想，因为对照品与杂质系同一种物质，其色谱行为相同。ChP2010采用高效液相色谱的方法进行检查，高效液相色谱具有灵敏度高、高专属性等优点，但是其使用成本较高，设备价格昂贵。本实验中采用薄层色谱法进行检查。
【实验材料、试剂与仪器】
原料名称 盐酸普鲁卡因注射液 乙 醇 对氨基苯甲酸 对二甲氨基苯甲醛溶液 展开剂 规 格 普通市售 AR AR 2%对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液100 mL，加入冰醋酸5 mL制成 用 量 1~2支 适 量 0.3 mg 适 量 适量 苯-冰醋酸-丙酮-甲醇(14:1:1:4) 容量瓶10 mL、100 mL各一个，薄层层析硅胶板，层析缸，点样管。
【实验方法与步骤】
1. 供试品溶液的制备
精密量取本品，加乙醇稀释使成每l mL中含盐酸普鲁卡因2.5 mg的溶液，作为供试品溶液。 2. 对照品溶液的制备
精密称取对氨基苯甲酸3 mg，置100 mL的容量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，既得。 3. 盐酸普鲁卡因注射液中对氨基苯甲酸的检查（ChP2010采用HPLC法）：
吸取上述两种溶液各10 μL，分别点于含有羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶薄层板上，用苯-冰醋酸-丙酮-甲醇(14:1:1:4)为展开剂。展开后，取出晾干，用对二甲氨基苯甲醛溶液喷雾显色。供试溶
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