【实验材料、试剂与仪器】
原料名称 对硝基苯酚 氯霉素 甲 醇 氯霉素眼药水 规 格 AR AR GR 普通市售 用 量 200 mg 100 mg 适量 1支 容量瓶，移液管，高效液相色谱仪。 【实验方法与步骤】 （一）实验条件
色谱仪 高效液相色谱仪 色谱柱 反相C18柱 温度 室温
流动相 内标法 甲醇: 水(60: 40)
外标法 甲醇: 水(80: 20)
流速 0.7 mL/min 检测器 UV检测器 （二）标准贮备液的制备
1. 1 mg / mL氯霉素标准贮备液的配制
精密称取氯霉素约100 mg置100 mL容量瓶中，以甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。 2. 2 mg/ mL对硝基苯酚 (内标)标准贮备液的配制
精密称取对硝基苯酚约200 mg置l00 mL量瓶中，以甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。 (三) 内标法测定氯霉素的含量
1. 相对校正因子的测定
分别精密加入氯霉素标准贮备液1，2，3，4，5 mL，置5个l0 mL容量瓶中，再分别精密吸取对硝基苯酚标准贮备液各2.5 mL用甲醇稀释至刻度，摇匀。待色谱仪基线平稳后，分别进样20 μL，得色谱图。测量对硝基苯酚及氯霉素峰面积或峰高，按公式计算相对校正因子，本实验中，由于峰形较窄，可采用峰高法。
2. 样品含量测定
精密吸取眼药水适量 (约相当于氯霉素500 mg，标示量为2.5 mg/ mL)，置l0 mL容量瓶中，并加入对硝基苯酚的贮备液2.5 mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀，进样20 μL，得色谱图。按下式计算标示量的百分含量
WihiW内标标示量%??100%???fi内标?100%
Wh内标W样品(四) 外标法测定氯霉素的含量
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1. 标准曲线的绘制
分别吸取氯霉素标准贮备液1、2、3、4、5 mL，置5个l0 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，各进样20 μL，以峰面积或峰高对浓度作图，得标准曲线。
2. 样品的测定
精密吸取眼药水适量(约相当于氯霉素2.5 mg)，置l0 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，进样20 μL，得色谱图，根据峰面积或峰高从标准曲线上查得相应的浓度，并计算标示量的百分含量。
【注意事项】
1. HPLC使用的流动相必须经滤膜过滤及脱气处理，可用超声波、机械真空泵或水力抽气泵脱气。 2. 严格防止气泡进入色谱系统。吸液软管必须充满流动相，吸液管的烧结不锈钢过滤器必须始终浸在溶剂内。如变换溶剂瓶，必须先停泵，再将过滤器移到新的溶剂瓶内，然后再开泵使用。
3. 色谱分析完成后，必须马上清洗柱子，避免过夜，以保证色谱柱的寿命。特别是反相柱用过含酸、碱或盐流动相后，应先用水冲洗，再用甲醇-水充分冲洗，每种冲洗溶剂一般冲洗30 min左右，特殊情况应延长冲洗时间。否则，残存的酸碱可能会侵蚀仪器部件，析出的盐类可能会堵塞管道。
本实验的流动相中含有醋酸盐缓冲液，故测定完毕后，要先用水冲洗柱子至基线平稳（约0~60 min以上），再用含水的甲醇溶液或纯甲醇溶液冲洗30~60 min。
4. 标准贮备液的配制应精密称定重量，先用少量甲醇溶解后，再用甲醇稀释至刻度，否则因部分未溶导致浓度不准确。
【思考题】
1. 怎样选择流动相？ 2. 内标物应具备哪些条件？
3. 变换溶剂时，直接将一种互不相溶的溶剂替换前一种溶剂，对色谱行为有何影响?如何消除这种影响?
实验八 维生素B1片剂的含量测定（5学时）
【实验目的与要求】
1. 掌握差示分光光度法消除可能存在干扰的原理； 2. 熟悉差示分光光度法的基本测定方法； 3. 了解维生素B1的结构与性质； 4. 熟悉维生素B1的检测原理及操作方法。
【实验原理】
1. 结构与性质
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H3CNNNH2N+SOHCl-.HClCH3C12H17ClN4OS.HCl 337
维生素B1由嘧啶环和噻唑环通过亚甲基结合而成的一种B族维生素，为白色结晶或结晶性粉末；溶于水，微溶于乙醇、氯仿，有微弱的特臭，味苦，有引湿性，露置在空气中，易吸收水分。在碱性溶液中容易分解变质。它的生理功能是能增进食欲，维持神经正常活动等，缺少它会得脚气病、神经性皮炎等。成人每天需摄入2 mg。它广泛存在于米糠、蛋黄、牛奶、番茄等食物中，已能由人工合成。 2. 测定原理
差示分光光度法（简称ΔA法），即在测定时，取两份相等的供试溶液，经不同的处理（如：调节不同的pH值或加入不同的反应试剂）后，一份置样品池中，另一份置参比池中，于适当的波长
1%?E1cm值计算出组分的含量。该法既保留了通常处，测其吸光度的差值（ΔA值），根据标准曲线或
的分光光度法简易快速、直接读数的优点，又无需事先对样品进行分离提纯，并能消除干扰。
本实验根据维生素B1的紫外吸收峰随溶液pH值的变化而变化，pH=2（0.1 mol/LHCl）时，最大吸收波长在246 nm处，吸收系数为421；pH=7（磷酸盐缓冲溶液）时，有两个吸收峰，在232～233 nm处，吸收系数为345；在266 nm处吸收系数为255。在两种不同的pH介质中，维生素B1的紫外吸收不受其它共存物的影响，即光谱行为不发生变化，从而消除了共存物的干扰。因此采用差示分光光度法测定其含量，可消除背景和辅料的干扰。
【实验材料、试剂与仪器】
原料名称 维生素B1 盐酸溶液 磷酸盐缓冲液 维生素B1片 规 格 AR pH = 2.0 pH = 7.0 普通市售 用 量 100 mg 适量 适量 20片
移液管，容量瓶100 mL（15个），50 mL（1个），紫外光谱仪，研钵。
【实验方法与步骤】
1. 标准贮备液的配制
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精密称取维生素B1约100 mg，置100 mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液（1 mg/ mL）。
2. 测定波长的选择
精密量取维生素B1贮备液2.0 mL二份，分别置于两个100 mL容量瓶中，一份用磷酸盐缓冲液（pH7.0）稀释至刻度，摇匀，得溶液Ⅰ；另一份用盐酸液（pH=2.0）稀释至刻度（浓度为0.002％），摇匀，得溶液 Ⅱ。分别以相应溶剂为空白，在220 nm~ 280 nm范围内测定各自的紫外吸收光谱。再将溶液Ⅰ放于参比池，溶液Ⅱ放于样品池，在同样光谱范围内测定差示吸收光谱（见图1）。在差示光谱图上寻找有最大差示吸收值（ΔA）的波长，即为测定波长（247 nm）。
3. 标准曲线的绘制
精密量取维生素B1贮备液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL各二份，分别置100 mL量瓶中。一份用磷酸盐缓冲液（pH7.0）稀释至刻度；另一份用盐酸液（pH=2.0）稀释至刻度，摇匀，
得五组浓度相同、pH不同的溶液。在上述五组不同浓度下，以缓冲液配制的溶液为参比，在测定波长（247 nm）处分别测定对应的盐酸液的差示吸收值（ΔA）。以浓度C为横坐标，以差示吸收值ΔA为纵坐标，绘制标准曲线。
4. 维生素B1片的测定
取维生素B1 20片，精密称定，研细。精密称取适量粉末（约相当于维生素B1 50 mg），置50 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，弃去初滤液。精密量取续滤液2.0 mL二份，分别置100 mL量瓶中，分别用磷酸盐缓冲液和盐酸液稀释至刻度，摇匀。将前者置参比池中，后者置样品池中。在247 nm波长处测定差示吸收值。由标准曲线求得维生素B1浓度，计算维生素B1片含量（标示量的百分数）。
【注意事项】
1. 缓冲液（pH 7.0）：取磷酸二氢钾0.68 g，加氢氧化钠（0.1 mol/L）29.1 mL，用水稀释至100 mL，即得。
2. 盐酸液（pH 2.0）：取盐酸9 mL，加水稀释成100 mL。取10 mL，加水稀释成1000 mL，即得。
3. 所给测定波长仅供参考，可照“测定波长的选择”项下自行测定。
4. 本实验线性范围为10~30 μg/ mL，其回归方程：ΔA＝0.002＋0.0213C，r ＝0.9996。
【思考题】
1. 试述差示分光光度法如何消除干扰物的影响？
2. 差示分光光度发用于制剂分析或原料药测定，主要有哪几种方法类型？ 3. 在选择试验条件时，是否应考虑赋形剂等辅料的影响？如何进行？
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实验九 维生素AD胶丸中维生素A的含量测定（4 学时）
【实验目的与要求】
1. 熟悉胶丸制剂分析的方法和基本操作；
2. 掌握紫外三点校正法测定维生素A含量的原理和方法。
【实验原理】
1. 结构与性质
CH3CH3CH3CH2OCOCH3CH3CH3
C22H32O2 328.49 维生素A醋酸酯
维生素AD胶丸系维生素A、维生素D2、维生素D3，加鱼肝油或精炼食用植物油(在0 ℃左右脱去固体脂肪）溶解并调整浓度后制成。每丸含维生素A应为标示量的90.0%~120.0%。 2. 检测原理
三点校正法即先在三个波长处测定吸光度值，然后在规定的条件下，根据校正公式进行校正后，再进行计算。
维生素AD胶丸除含有全反式维生素A醋酸酯外，还含有少量对测定有影响的杂质，主要包括维生素A异构体、维生素A2、维生素A3、维生素A的氧化物、无生物活性的聚合物鲸醇及合成时产生的中间体，它们各具不同的光谱特征和生物效价。全反式维生素A醋酸酯在环己烷中最大吸收波长为328 nm，而以上所述杂质的相关吸收在316~340 nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸光度变小。为了得到准确的测定结果，根据物质对光吸收具有加和性的特点，采用三点校正法可消除这些杂质的干扰。
【实验材料、试剂与仪器】
原料名称 维生素AD胶囊 环己烷 乙 醚 规 格 普通市售 AR AR 用 量 20粒 适量 适量
紫外-可见分光光度计，注射器；刀片，烧杯，移液管。
【实验方法与步骤】
1. 胶丸内容物平均装量的测定
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