每一个细胞显示四种不同的形态，包括圆形，块状，葡萄状，星状，它们与肿瘤细胞的侵袭和转移的起源细胞有联系。此外，他们还表明基因编码信号转导蛋白的可靠差异显现当肿瘤细胞在三维微环境中培养时。此外，基质胶已被证明是一种有效的血管生成检测工具，单独或与各种血管细胞，可用于识别亲和或抗血管生成的分子，包括那些参与血管生成的基因和信号通路的分子[77,78 ] 。它一直使用血管细胞，如内皮祖细胞，人脐静脉内皮细胞（HUVEC），来自SV小鼠的内皮细胞（SVEC4-10），以及人皮肤微血管内皮细胞-1（HDMEC-1）[ 79-81 ]。例如，瓦特和同事利用缺少生长因子的基质胶与脐带血派生的内皮细胞克隆形成细胞（ECFCs）一起在最近的一项研究中使用[ 81 ]。他们测试了抑制血管生成的血管生成抑制剂，suramin和SU6668，以找到评价血管生成兴奋剂或抑制剂两种量化方法，如angiosys和wimasis，的疗效最好的量化方法。此外，使用基质胶的血管生成实验现在结合其他新兴技术，创建更先进的工具，以评估血管生成。Kleinman和同事建立了一个协议，可以提供一种快速、定量、可靠的体外高通量血管生成实验[ 77 ]。
胶原蛋白，在自体ECMs中最丰富的蛋白质，它支持各种血管细胞的血管形态和网络形成。胶原水凝胶广泛用于范围广泛的生物医学细胞微环境，因其生物相容性和生物降解性[ 82,83 ]。胶原水凝胶可以通过多个交联方法制备，可以生成和在天然ECM中发现的胶原蛋白相似的纤维结构 [ 84,85 ]。这些水凝胶可以提供生物活性微环境支持细胞行为，由于它们的细胞活性，如细胞粘附配体和蛋白水解降解
位点，他们对于ECM的重塑是至关重要的。Rylander和他的同事们已经建立了一个三维工程肿瘤模型，作为一个平台，为更好了解体外实体肿瘤生物学[ 30 ]。他们证明，MDA-MB-231乳腺癌细胞培养在胶原I型水凝胶上形成三维癌症球体（直径150–200μm），诱核内的坏死和缺氧。他们也证明了生物工程肿瘤显示了血管生成的潜力，通过上调HIF-1α和VEGF-A相对于二维单层MDA-MB-231细胞的培养。最近，他们已经研究了使用Ⅰ型胶原水凝胶由肿瘤及内皮细胞共培养系统诱导肿瘤血管生成的研究[ 86 ]。他们成功地利用了体外肿瘤血管生成模型，仅仅通过MDA-MB-231细胞和端粒酶永生化人微血管内皮细胞（TIME）旁分泌效应驱动。这个设计的肿瘤模型由三层水凝胶层；1）底层，MDA-MB-231细胞与胶原水凝胶；2）中间层，无细胞胶原水凝胶；和3）顶层，TIME细胞和胶原水凝胶。使用该模型，他们发现，TIME细胞与MDA-MB-231细胞共培养表现出细胞增殖增加明显和促进TIME细胞的血管形态，以及促进侵入性地萌芽到无细胞胶原基质，血管生成效率取决于血管内皮生长因子的分泌，基质浓度，以及培养时间。
纤维蛋白原是一种大的糖蛋白，在血浆中发现，在凝血，纤溶，细胞和基质相互作用，炎症反应，伤口愈合，肿瘤方面起着至关重要的作用，[ 87 ]。纤维蛋白水凝胶是通过纤维蛋白原与凝血酶和钙离子聚合而形成的。纤维蛋白水凝胶已被广泛用作人工微环境，因为他们有一个纳米/宏纤维结构，可以模仿天然细胞外基质。黄和他的同事们发现水凝胶的刚度在小鼠B16-F1黑色素瘤细胞的干细胞样癌细
胞特性中扮演着重要的角色[ 88 ]。他们把细胞封装在从90到1050Pa不同机械性质的纤维蛋白水凝胶中，然后评估其形态与干细胞样特性。当细胞培养在90Pa纤维蛋白胶中，他们形成了较大的肿瘤球体和高表达干细胞标志物，导致侵袭性肿瘤转移到肺组织，即使只注射10到100个细胞到小鼠皮下组织。
尽管天然水凝胶材料广泛用于3D微环境研究肿瘤的生长和血管生成，他们仍然有重要的缺点，被用作定义明确的肿瘤微环境，由于相对较窄的物理性质范围，独立地有限的控制基质刚度和细胞粘附多肽密度的能力，以及固有的批处理可变性[ 89 ]。 3.2、合成水凝胶材料
为了克服天然水凝胶的局限性，一直努力专注于从天然和合成聚合物中开发合成水凝胶。许多合成水凝胶被用作支持肿瘤细胞生长和肿瘤血管生成的微环境，通过控制无数的参数，如蛋白水解降解，细胞粘附位点，和基质刚度。
透明质酸（HA）已被证明是一个重要的细胞外基质分子，作用于肿瘤的生长和侵袭[ 90,91 ]。法拉奇卡森和同事们已经开发出一种三维培养系统，对不贴壁骨转移的前列腺癌细胞（C4-2B），作为一个体外实验平台进行抗癌药物筛选[ 92 ]。为了生成一种仿生的体外肿瘤模型，他们合成了含HA-醛和HA-酰肼的透明质酸可以通过带有脱水的亚胺交联形成。培养细胞三维透明质酸基质表现出明显的聚集结构，让人联想到真正的肿瘤，也表现出较高的耐药性，相比于二维单层培养。
可溶性因子信号的时空复杂度被认为是肿瘤进展的一个重要因素[89 ]。最近，他们成功地利用一个工程肿瘤微环境，它是使有HA水凝胶和表皮生长因子-肝素水凝胶颗粒（EGF-HGP）的双层结构[ 93 ]。为了模仿肿瘤和基质相互作用，EGF HGPS被纳入上凝胶层，LNCaP前列腺癌细胞封装在底层。持续释放的表皮生长因子使肿瘤的生长扩大，在7天的培养后平均直径达85 μm。他们表明，该肿瘤球体明显增加VEGF和IL-8的表达，表明HA肿瘤模型为肿瘤细胞对生长因子反应的研究提供了一个有用的平台。
此外，HA水凝胶已用作3D微环境，用于创建从头设计的血管。朝着这个，HA水凝胶应根据与细胞黏附配体（即RGD肽）和基质金属蛋白酶敏感的裂解位点作为细胞微环境。最近，我们已经开发了原位交联的HA凝胶，装饰有RGD和基质金属蛋白酶敏感肽，用于支持ECFCs的血管形态[ 21,94 ]。我们合成了丙烯酸透明质酸（AHA）聚合物作为骨架，并将其与RGD肽和基质金属蛋白酶裂解的交联剂通过米迦勒型加成反应形成水凝胶。我们证明，合成的AHA水凝胶支持血管形态发生的过程，包括液泡和管腔形成，血管分支和发芽，通过整合素介导的细胞粘附和基质降解蛋白酶介导的。我们也使用HA水凝胶、ECFCs[ 94 ]和早期血管细胞（EVCs）（来自人类多能干细胞（hPSCs）[ 95 ]）创造了从头设计的脉管系统。AHA水凝胶提供3D细胞微环境，支持自组织微血管网络从细胞产生多细胞网络，它可以在体内移植存活以及与宿主循环系统结合。此外，我们评估HA水凝胶的基质重塑对血管形态和ECFCs出芽的影响，通过次
级自由基聚合建立空间图形[ 21 ]。这个结果表明，通过控制基质退化的提示，AHA水凝胶既可以在体外支持也可以抑制ECFCs的血管发生和血管生成，也包括来自于尿囊绒毛膜的血管生成。
聚（乙二醇）（PEG-）为基础的水凝胶材料被称具有代表性的合成生物材料。这些PEG水凝胶材料已被证明可以作为三维微环境支持细胞生长，由于其生物相容性，高含水量，以及多调谐特性。由于缺乏PEG分子的生物活性，PEG水凝胶应该装饰有生物活性的分子（即细胞粘附肽，RGD；蛋白水解降解位点，MMP敏感肽序列），或结合生物大分子（如胶原，明胶，或纤维蛋白原），来作为细胞微环境。这些设计的基质已经被用于支持肿瘤生长和血管生成的研究。最近，West和他的同事们研究了在肺腺癌模型中PEG水凝胶与独立可调生物化学的和机械性能的上皮形态发生的转移细胞株（344SQ）和上皮-间质转化（EMT）的效率[ 67 ]。他们证明了344SQ细胞培养在RGD和MMP降解位点修饰的PEG上，显示出管腔化的上皮球体，与在基质胶中3D培养看到的情况可以比拟的。此外，他们发现改变基质刚度和RGD浓度显著影响上皮形态发生。这些结果表明，所设计的微环境可以利用来定义基质线索，它们可以影响肿瘤形态发生，表明他们在癌症生物学方面的潜力。类似的研究由Jabbari和同事们进行了。他们研究PEG水凝胶的基质刚度对肿瘤干细胞（CSCs）和它们球体形成的影响[ 96 ]。PEG水凝胶可以被制备成具有不同的机械性能范围，从2.5～47.1 kPa。有趣的是，4T1小鼠乳腺癌细胞封装入5.3 kpa系数的水凝胶中表现出最大的肿瘤球和最高密度的肿瘤