球，以及最高密度的表达乳腺癌干细胞标记物 CD44和ABCG2。这些结果表明PEG水凝胶可以作为一个三维工程基质来研究个体参数在肿瘤微环境中肿瘤血管生成和肿瘤干细胞维护方面的作用。 4、体外模拟肿瘤血管生成
评估肿瘤血管生成的早期的临床前方法之一就是使用体内小鼠模型和组织学上测量微血管密度，利用血管内皮细胞标记物[ 97,98 ]。虽然这种方法仍然是一个有用的预后指标，微血管密度通常是不能预测抗血管生成疗法，由于它不能准确地预测临床结局这些年它的使用已经大大减少[ 18 ]。最近的努力都集中在发展功能和靶向性成像技术，以更好地在体内可视化和模拟肿瘤血管生成[ 99-101 ]，但这些方法需要专门的软件和设备来分析，并且体内样品是昂贵的，以及缺乏结果的，这些结果是一致的以及高度可比的[ 102 ]。此外，高通量药物筛选通过体内模型是不切实际的。
在综述生理肿瘤血管微环境和产生预测结果方面许多二维体外模型是不能胜任的，它们阻碍了许多研究人员进行必要的临床前研究。最近的在发展的基质，，与体内条件具有可比性的，使用水凝胶缓慢的帮助体外研究获得更高的可靠性。在这一节中，我们回顾了目前正在使用的不同的策略用水凝胶评价血管生成和探索仿生模型，它具有可用于研究肿瘤血管生成和抗血管生成药物筛选的潜能。 4.1、三维肿瘤血管生成实验
正如前面章节所提到的，各种基质包括自然衍生和合成材料已被证明是能够操纵内皮细胞行为从而形成血管结构的。许多研究已经利
用内皮细胞在这些环境中的发芽能力来研究不同的促进和抑制血管生成的因子对血管生成的影响[ 102–104 ]。一般来说，这些模型包括一个薄的水凝胶层，单层的内皮细胞被接种在胶的顶部（图3a）。血管生成的程度进行评估和量化，通过计算侵袭密度和测量内皮细胞出芽侵袭到凝胶的距离。相似的测量可以通过涂层带有内皮细胞的微载体珠和把它们嵌入到基质而获得[ 104 ]。这些方法目前用于研究血管生成机制，如筛选抗血管生成剂和不同的水凝胶基质的刚度[ 21，105 ]。内皮细胞还可与肿瘤细胞共培养嵌入基质内，来研究没有外源性生长因子条件下这些细胞诱导的血管生成[ 106 ]。此外，可以操作凝胶基质的不同的设计参数来研究细胞外基质成分和力学性能对于血管生成的影响。
内皮细胞侵袭实验已允许研究人员进行基本实验，涉及血管生成，但它缺乏其他类型的细胞在血管生成过程中一个至关重要的作用，如周细胞。正如在上一节中讨论的，壁细胞的招募对于肿瘤血管形成是一个关键的组成部分，因此模拟肿瘤细胞和其他多种细胞类型之间的相互作用可以对肿瘤血管生成提供一个更好的理解[ 107-109 ]。体外实验可以提供更多的生理相关的体外血管生成模型，相比于通过允许调节涉及一些细胞类型的新生血管形成的侵袭实验[ 110 ]。这些实验一般涉及嵌入动物或人类血管外植体到水凝胶基质中（图3b）。大鼠主动脉环法最早出现在1990年，但现在的外植体来自猪等等[ 104，110 ]。近日，Bussolino和他的同事已经开发出一种新的体外试验，使用动脉从人脐带的外植体，因为它更多的与临床
相关[ 34 ]。他们的模型解决了其他动物体内模型的缺点，如年龄和应变依赖性的变异，自治血管生成能力，和特定物种的血管生成标志物，它们可以导致在转换到临床试验中产生误导性数据[ 34 ]。他们表明，这种方法可以用于模拟人类肿瘤血管形成，通过外植体和肿瘤细胞团块共培养包被入基底膜提取物（BME）凝胶中，没有额外的生长因子。在30天到35天左右时观察到的最大的血管生成，以及更多的分支结构，相比于在单独培养基存在的情况下[ 34 ]。随着活体成像技术的运用，作者注意到他们模型的动态分析在一个可控微环境下的肿瘤血管生成的潜力[ 34 ]。另一个体外模型是不久前的雷帝斯柯和他的同事建立的，他们从静脉和动脉外植体创建定向的微血管生长。来源于人脐带的静脉和动脉外植体被放置在聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面的每侧，盖有壳聚糖-胶原水凝胶，0.5 - 1毫米，把它们各自分开[ 111 ]。外植体之间的间隙是50μm宽的凹槽图案，由柔软的印刷技术创建，它担任地形线索来引导外植体血管的生长。作者刺激和加速血管生长，通过一个血管生成因子Tβ4封装入凝胶，但是该模型具有研究肿瘤血管生成的潜能，与Bussolino的模型类似。 4.2、血管生成的高级仿生模型
虽然上述实验可以提供一个一般性的和初步的指导，用于研究特定组织模型的血管生成能力，但是这些实验是有限的，它们没有能力来预测体内的血管生成活动，由于它们与本身进程的解剖不相似，包括连续的流体流动，它能影响内皮细胞的基因表达谱[ 104 ]。为了解决这些问题，并结合额外的复杂性，最近结合水凝胶基质与微流控通
道来创建天然的微血管，从中新血管能出芽。不像上面描述的出芽试验，在一个平面上研究个体内皮细胞的侵袭，这些模型允许来源于带有流体流动的天然微血管的血管形成的真实三维观察，类似于在体内条件。
一种健全的的方法是创建一个微流体通道，内有水凝胶基质，放置一个圆柱形的模子（像一根针）通过凝胶与它交联。在水凝胶基质的交联之后，将针轻轻地取出，基质仍然留在那，带有一个圆柱形的微流控通道，用于灌注研究。例如，Tien和他的同事们使用了一个120μm直径，15毫米长的不锈针，用1%牛血清白蛋白包裹，以创建一个微流体管道，管内有胶原蛋白水凝胶[ 112 ]。他们然后介绍了内皮细胞（HUVECs或HDMECs）以悬液形式进入管内，创建一个融合的沿管的细胞层。这创造了一个微血管，带有可行的屏障功能和炎症刺激快速反应[ 112 ]。Khademhosseini和他的同事们也用这种方法来测试在甲基丙烯酸明胶凝胶上创建微血管的能力。用直径300μm的规范针来塑造管道，以及成纤维细胞包被入明胶水凝胶中。通过构建的管道接种人脐静脉内皮细胞创造功能性的灌注微血管，也表明共培养模型对于血管生成的潜能[ 113 ]。
Stroock和他的同事最近建立了体外微血管网络，由流体流动所支持，通过嵌入带有胶原水凝胶的的微流体通道[ 49，114 ]。100μm宽的槽在顶部的水凝胶层的底部，是由光刻所创建，这概述了微血管网络。当密封在底部凝胶层的有机玻璃室，槽区成为微流控通道，其中培养基可以流动。通过通道接种人脐静脉内皮细胞创造了一个微血
管结构，带有渗透性屏障，与生理结构相当[ 49 ]。当内皮细胞传播与增殖时，内皮细胞可以重塑改造周围的胶原水凝胶。在这个模型中促血管生成因子可以流过通道和/或不同类型的细胞可以嵌入在胶原水凝胶以诱导血管生成，这可以从既定的微血管网中内皮细胞出芽的程度来评估。在他们的研究中，Stroock和他的同事们发现当人脑血管周细胞被包被入间隙胶原基质时，内皮细胞从血管网中萌发，周细胞被认为可以分泌VEGF和FGF[ 49 ]。他们的模型也可以用于研究血栓形成，通过用生理成分代替培养基灌注血管。该技术的主要目的是创建体外血管化组织，但Stroock凸显了这个模型的多功能性，认为它也可以应用于肿瘤系统在体外来研究肿瘤的血管生成能力和炎症[ 6，8 ]。制造设备的详细方法可以在他们发表的协议中找到[ 114 ]。
三维打印技术的进步最近启发了生物工程师开发体外的打印器官的方法。被称为“生物打印”，该技术利用逐层添加生物墨水，既可以液滴形式也可以以线性形式，它们中包含有活细胞[ 115 ]。水凝胶已被广泛用作生物墨水，因为它可以封装细胞，由于其高生物相容性和可调粘度，这使得打印组织的结构完整性保持平衡[ 116 ]。随着时间的推移，这些个体层自组装成三维组织，通过空间和环境的指引，与观察到的胚胎发育过程相似[ 117 ]。通过合并不同类型的细胞和水凝胶，生物打印研究旨在一天建立完整的有功能的器官，具有生理复杂性和足够的血管。应用这些原则，已经尝试制造血管样结构（图3C）[ 118，119 ]。然而，这些努力揭示了一些挑战，如这些构造方法的低伸缩性和组织自组装的持续很久的时间[ 120 ]。此外，生物打