6.1 受试者采样前准备
如第5节所描述, 参考个体的选择必须严格许多条件。受试者不充分或偏离标准状态下的准备可能会导致结果的不准确或数据的偏离。标准状态的设定是根据生物学变异对分析物的影响程度来定的。表3和表4归纳了必须引起注意的，有关受试者采样前准备的几种重要因素。 表3 重要因素一览表
生物学因素 代谢性的 血液动力学的 酶的诱导 细胞损伤 方法学因素 样本的采集 样本的运输 样本的处理 变异性起源及其标准化 特异性因素 （仰卧位vs直立位） 多种因素（见表2） 采样前进食将会影响多数实验室结果, 这种影响既有直接的 (如改变分析物浓度) 也有间接的(脂质成分的干扰) 。相反地，长时间的禁食也将导致实验结果的改变。日常饮食中有些食物也会使多数分析物受到影响，像咖啡因、乙醇、烟草和维生素C等。因此，在评估病人或受试者的准备方案时，一定要考虑是否进食过上述或别的其他食物。
运动和采样过程中的体位均能改变实验结果。就像上节叙述的那样，当我们比较住院病人和门诊病人检测结果时, 发现其体位的变化对结果影响非常大，故经常要为某些分析物建立几种的参考区间。另外，还有一些采样前能影响分析物浓度的因素必须加以考虑，如分析物生理周期性的波动, 季节性的影响和种族背景等。但上述诸多因素均能够通过适当的排除标准得到消除。 图表4. 分析前的影响因素
受试者的准备 事先的禁食 禁食vs非禁食 药物介入戒酒 药物养生法 取样时间和生物节律相关 体育锻炼 采集前休息间隔 紧张 样本的采集 采样时的环境 时间 体位 样本类型 采样部位 血流变 采样设备 采样技术 样本的处理 样本运输 样本凝固状态 血清或血浆的分离 样本储存 准备样本分析过程 6.2 样品类型和样本的收集、处理及储存
实验室应有一本指导人们如何进行样本收集、处理和储存的手册，以便当医师解读病人检测结果的时候医生能适当地利用参考区间。实验室还应特别指定不同的试管来收集血清样品、血浆样品或者全血样品(参见 NCCLS 文件 H3－静脉血样品的收集程序；H4－外周血的样品收集程序和装置；H11－动脉血样品的收集程序；H21－抗凝血的收集、运输和处
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理及抗凝方法)。
还应考虑到样品是否应该是维持在真空状态(例如钙离子的检测)。对用来收集液体的真空管和注射器的类型的使用理解非常重要。分离血清或血浆的方式管和硅化过的注射器能干扰某些测试，甚至可能导致错误的结果。应尽快将样本中的红血球和其他细胞的碎片分离出来。实验室工作人员应该慎重地考虑某些问题，当采样条件偏离标准草案后出现潜在干扰效应等问题时，实验室工作人员应从已报道的文献中寻找解决方法。
6.2.1 血液
如果我们选择的是血样本,那么需要的是动脉血,还是静脉血, 抑或是毛细血管血；还有样品是否需要抗凝，假如要抗凝，可以选用何种抗凝剂，这些我们都必须事先做出规定。另外，还必须描述清楚标准化的样品是采自静脉血还是外周血 (参见 NCCLS 文件 H3－静脉血样品的收集程序；H4－外周血的样品收集程序和装置) 。
6.2.2 排泄物和分泌物
如果采集的样品是来自血液之外的其他液体, 同样必须制定一个指南来指导这些液体的收集、运输和处理操作，尽管这些操作通常不在实验室的控制之下。这些液体包括尿液 (参见 NCCLS 文件 GP16- 尿液样本的收集、运输和防腐及常规分析),脑脊液，胸水, 心包液, 腹水,关节液和羊水和唾液。有时，我们只需在抽取血样时同时收集即可, 但在许多时候，这些液体更合适的收集方式是在规定时间内。就像血样本采集时关键问题在于使用合适的保存剂和抗凝剂，而在24h的尿液收集时, 尿液收集是否完全公认的有效方法是检测尿液中肌酐水平来确定。
6.2.3 温度
收集和处理某些样品时可能需在特定的温度下进行(如37℃，室温或冰冻)。另外， 某些样品(或分析物)的保存将会需要规定在特殊的温度下储存，或者可能要在指定的温度 (-20 C 或 -70 C ) 冰冻保存。实验室必须创造条件并严格保证它们的储存温度需要。一般情况下，样品收集之后均应该及时处理加工。处理加工过程是指在特定的温度下将血清或血浆与凝块和红血球尽可能快地分离(参见NCCLS 文件H18-血样本的处理和加工程序)。
6.3 分析方法性能
实验室提供的数据的有效性是至关重要的。因此样品分析的方法必须阐述清楚，描述的内容包括方法的不准确度、不精密度, 最低检测限，线性范围、回收率和影响因素。
其他要求考虑的影响分析性能因素有使用的设备或仪器，试剂(包括蒸馏水), 定标液和计算方法。如果相同分析物不断进行重复检测的话，建立的参考区间必须考虑包含批间
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技术人员间、仪器之间的变异。以上所有因素应在分析系统中描述清楚。
分析检测所获得的数据的可靠性非常重要。 因为方法学的不精密度和不准确性将决定它的诊断效用。因此,无论是在建立参考区间过程，还是在同样形式下进行患者样本检测中均必须使用日常质控物。这不仅可以监控分析的整个操作过程，也能确保长期检测结果的一致性（参见NCCLS 文件 C24-定量检测的统计学质量控制: 准则和定义）。通过连续几天的样本分析所获得的数据才是理想的数据，因为该值能代表各分析批的平均变异值。除此之外,分析物中自然出现的干扰组份的评价也极其重要。
7.参考值分析
本指南的参考区间指的是两个数（含这两个数）之间，即最高限和最低限的之间的全部数组成的区间，从参考人群中抽出来的个体检测值可以用一个特定的百分比(通常 是95%)来评估，就是说这些检测值有95％要落在这个区间内。对于大部分被分析物而言，低于最低限和高于最高限的值均被分别认为分布在第 2.5 和第 97.5个百分位点之外。有些情况是只有一个参考限有意义，通常是高限，即第97.5个百分位数。
决定这些参考限的二个常用的统计方法是采用非参数和参数程序。这些程序的整个细节部份均在由EPTRV的 Solberg 编写的已出版的文件5 中描述。非参数的方法不需要利用特别的数学表格来评估被观测参考值的可能性分布。而实际应用中的有参数方法,假定的参考观测值, 或一些用数学转化而来的那些值,是遵循高斯(即“正态”)分布曲线的。因为多数分析物的参考值不遵循高斯排列,故使用参数方法时需要将这些参考值转换成一些其他的度量单位,即将他们“正态化”。当然应根据需要选择最相配的转换形式(如对数形式，幂形式，或一些其他的功能的原始刻度)。然后在这新的刻度上检验参考值是否真正遵照高斯分布。这要涉及一些对应的综合统计理论和相关的计算机程序。有关这些内容的详细讨论可参阅EPTRV 出版文献附录B和C。
非参数的方法就要简单得多,只要将参考数据按从小到大逐渐增加的等级排列好。此外,可靠的参考区间的建立首要考虑的问题是，选择合适的参考受试者，测试的数量应充足,防范来源于分析前的错误，不用统计学的方法从观测数据中评估参考区间。因此，非参数的方法受到推荐,虽然一个实验室如果需要的话，使用参数方法时统计学和计算机技术的应用应该是得心应手的。在本指南7.4节中讨论了采用非参数方法，为二个分析物（血清钙和
丙氨酸转氨酶）评估参考区间的内容。
7.1 参考值的最小数量
使用非参数的方法,区分两种分布的百分位数（即P%）之间是不可能的，除非至少已经
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获得的观测例数为n=(100/P)－1。理由是，一个非参数的方法是基于独自的观测值的大小等级排列而不考虑他们的测量值。举例来说，如果随机地从某群体中观测到某样本的9个观测值，当这九个观测值按大小排好次序后，只能获得九个百分位数的估计。最小的观测值是非参数方法估计的人群中第10个百分位数；最大的观测值是非参数方法估计的人群中第90个百分位数。因此，正如上述公式所描述，有九位观测值的样品【9=(100/P)－1,P=10.0】时，9就代表着需要最小的样本数，方能获得性质不同的非参数方法的估计十分位数,换句话说，规定为人群的百分位数应是10%才能分别彼此。
同样地, 从第5个百分位中去评价第 2.5个百分位, 或从第 97.5百分位中去评价第 95个百分位 (即 P=2.5)时, 最少的检测数应该是39 。采用非参数方法估计，最小的样品观测值会是在人群中的第 2.5个百分位, 而最大的样品观测值会是在人群中的第 97.5个百分位。
为了得到一个非参数法的 95% 参考区间而完全仰赖极端观测值，无疑是不受欢迎的。 这些可能是变化了的或者说是不能代表人群的真实百分位值。 Reed等人建议，一个人要进行参考值研究，最小的可靠观测量是120 。这样也就有利于让每个参考限均被90% 的可信限非参数地估算 (参见 7.5 节) 。用同样百分数去评估95%可信限的参考限，需要 153个 参考值；去评估99%可信限的参考限，需要 198个参考值； Linnet等建议对于严重偏态分布的结果，研究数量可以高达700 。当然，小组委员会认为实际工作中的标准，120例是推荐的最小量。
这个数当然是在假设没有观测者从参考群体组中被剔除的情况下规定的(见7.2 节)。建立每个参考区间时，倘若有异常值或离群值需要剔除,一定要注意及时选择别的受试者进行补充，直到能获得至少120 个可接受的参考值。而且,假如要确立分组（如不同性别组或不同年龄段组）的参考区间，每个组别的推荐参考观测数量至少也是120。
在有些群体中某种组别的参考个体（如新生儿，儿童，老年人）不容易获得的情况下，收集120个也许有些困难。如果可能的话, 允许研究年龄相仿的足够的参考个体。无论获得多大量的参考值, 数据应该仍然是根据非参数方法分析而且根据适当的百分位报告。
7.2 偏离样本的处理
评估参考限的一项重要的暗示性假设就是该批测量的参考值来自于“同质的”样本。也就是说所有的参考值均来自于同样的分布概率之下(即使用非参数的方法时这种分布格式没有特别规定)。
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也许所有的参考值均能满足这种“同质的”情形, 但是总会有一个或二个人会出现超过同群人的概率分布范围。当这些值位于所有值之中时, 实际工作中要辨别他们非常困难。 除非此人在接受生化指标的检查时碰巧又发现这些观测值处于不正常的情况，或者是处理结果时出现一些算术或程序上的错误。不过，这些“偏移”值经常位于剩余测量的值域之外，他们很容易被确认为“离群值”而引起注意。
除非离群值是事先知道的偏移值 (如在剩余的检测中由于分析过程操作的错误或分析前的质量控制不到位)，否则，我们还是强调不要剔除它，即应该继续保留他们。假如一个极端值被剔除之后，基于至少 120 例观测者的非参数法评估的参考限应该变化很小, 甚至不会改变。
要检测出一个不规则的偏僻观测值，有许多统计学技术可以利用(参见Barnett和Lewis的研究报道)。多数这些试验是依赖于一个假设，即观测参考值是遵循高斯分布的。而且, 当个别地在极端值上进行离群值的验证时，总是会有较小极端的离群值被掩盖的可能。Dixon已经提出了一个在参考值评估领域中非常有名的D/R比率的建议，即1/3规则。D 指的是一个极端观测值(大的或小的值)和紧接着的极端观测值（第二大或第二小的值）之间的绝对差值，而 R 是指所有观测值的全距,即最大极值和最小极值的差值。 Reed等人建议D/R值的1/3 就可当作是否要剔除观测值的临界值。也就是说，如果某个观测值的 D 值是等于或大于1/3 R值,该极端值就要被剔除。Reed等人还指出，对于样品含量是120的群体, 这个标准是相当的保守。也就是说，在余下的接着观测者中，经常无法剔除那些真正不在分布区间的离群值。然而, 由于缺乏一个离群值就是真正偏移受试者的证据，导致在分布范围之外的值将会时常不是高斯分布形式。这时1/3的D/R规则似乎是合适的,尤其当参考区间是采用非参数方法来确定的。因此,我们建议那采用这个试验测试和临界值来验证一组观测参考值是否是统计学意义上的离群值。
当有二或三个离群值均出现在分布区间的同一侧时(如均极大或极小),这1/3规则(或任何类似的 D/R 规则) 不能辨别那个最极端离群值具有统计学上的意义，也就同时掩盖了其他的仅比最极端值轻微些的离群值的存在。在这种情形下, 应该采用1/3规则将那最极端的离群值当作是唯一的离群值对待。如果规则导致这一个离群值被剔除,那么自然地就会有更多真正的极端观测值也被剔除。假如规则不赞成剔除最极端值,那么我们就应该要么接受所有的极端值，要么（可二者择一）应用一个试验综合起来考虑所有的离群值。这个试验叫做封闭程序，具体做法可参见Barnett 和Lewis报道的文献。
当离群值被剔除之后,恰当的做法就是在剩余的数据中寻找另外一个可能的离群值。
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