r1 和r2的值是分别非常接近整数3 和118 :
r1 = 0.025 (121) = 3.025 ??3 (3) r2 = 0.975 (121) = 117.975 ??118 (4)
而当n = 240时, r1 和r2的值是分别接近整数6 和235。
使用这些受试参考人群的排序值来估计最高和最低参考限，获得以下95% 参考区间:
们所需要统计数据参见表7。
验证离子钙和ALT同年龄组的男性和女性之间平均值的区别有无统计学上的意义，我
图表7. 120例青年男子和120例青年女子钙和 Loge ALT 的平均值和标准差
被分析物 钙（mg/dL） logeALT(lo U/L) 平均值 男子 9.8 3.2 女子 9.57 2.78 标准差 男子 3.1 0.46 女子 2.9 0.44
将这些统计数据代入公式（1）中求z值，结果如下:
从上面结果可以看到，两个z值都超出了当样本含量为120时标准z值3 ，这意味着必须考虑为性别差异而建立不同的参考区间。但是，对于像离子钙这种分析物，尽管从生理角度看好像年轻男性离子钙平均水平要高于年轻女性，但男女不同的参考区间的临床重
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要性似乎难以理解。假如有一个更大的样本含量, 不同性别的参考范围之间区别的临床意义也许会出现。所以，对于钙,实验室在建立这个年龄组男女离子钙参考区间时，可以选择只提供9.1～10.3 mg/dL的单一参考范围。离子钙分析方法的不精密度也许具有可比性，而且他们的变化可能在临床意义上和医师的反应上都相对比较小。
对于ALT, 用于为临床诊断目的而设立的不同性别有不同的参考区间的确具有临床意义。而且也有生理证据支持这个结论。
7.5参考限的置信度
选择受试者样本进行参考限计算就是研究人群相应百分数的评估。从同样人群中的其它抽样也许会得出稍微有些不同的参考限。利用样本提供的信息来识别和评定样本估算时的可变性，一个非常有用的方法是计算样品中百分数的可信区间。在现有条件下, 一个可信区间就是一个观测值的分布范围，包括指定概率中的真实的百分数(即总体的第2.5个百分数)，通常90 或95% 。这种概率叫做“置信水平”的间距。
可信区间的概念是基于一种假设，即有代表性的观测者(在本文件又称为参考个体)是来自于从某些特定的人群中抽样。这意味着总体中的每个成员均有相同的机会被抽中。但事实上这种理想的状态经常是难以实现。我们期望的最大可能是, 在控制好标准的分析前状况下，选择参考个体进行抽样时参考样本真正来自于可靠的健康人。参考个体至少是从某个定义好的群体（例如实验室员工）中随意地抽取。因此，有关可信区间是否可靠的基本假设，获得的观测值是各自独立的，而且即使不是严格的随机抽样也要保证参考样本具有总体代表性。
然而，有两个理由表明可信区间是有用的。首先，它们提醒了研究人员要进行变异性评估并提供可变性评估的定量测定方法。其次, 当采集的样本量增加时可信区间就会变窄。所以,研究人员可以采取增加参考个体的样本含量来提高评估的参考区间的精密度。
非参数法的可信区间是由相应的观测值的秩来决定的。表8展示了一个由样本量大小决定的第2.5个百分位数而定义的90%可信区间（CI）的观测值的秩。
表8：第2.5个百分位数定义的90%可信区间的观测值的秩。【摘自美国临床化学委员会出版的《临床化学》1971年第17期275～284页（表3）】
a为最少样本的秩值，即研究目标群体第2.5百分点的90％可信区间的参考低限值；b为最少样本的秩值，即研究目标群体第2.5百分点的90％可信区间的参考高限值；要获得研究目标群体第97.5百分点的90％可信区间相应的样本秩值，只需将样本例数为（n+1）中减去a和b值即可。
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样本例数，n 最少例数 最多例数 120 131 132 159 160 187 188 189 190 216 217 246 247 251 252 276 277 307 308 310 311 338 339 366 367 369 秩 a 1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 5 b 7 8 9 10 10 11 12 12 13 14 14 15 15
举一个例子，当一个参考样本是由120人组成时，观测值90％可信区间的最低参考限相应的秩数为1和7。为获得90％可信区间的最高参考限相应的秩值，上述秩数应该减去由121例（一般为n+1）所获得的秩，即114和120。因此，最小的观测值就是90％可信区间的最低参考限，而最大的观测值为90％可信区间的高参考限。
综合表8所列秩数和表5、表6的原始数据，表9展示了90％可信区间的血清离子钙和ALT的最高及最低参考限。
表9 95％的最低和最高参考限的90％可信区间 被分析物 钙（mg/dL） 女性（n＝120） 男性（n＝120） 总体（n＝204） ALT（U/L） 女性（n＝120） 男性（n＝120） 总体（n＝204） 最低参考限 8.8－89.1 9.1－9.3 8.8－9.1 5－8 9－11 6－9 最高参考限 10.1－10.3 10.3－10.6 10.3－10.6 36－65 51－69 49－65 注：mg/dL * 0.02495＝mmol/L
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8 参考区间的调用和验证
8.1参考区间的调用
确立一个可靠的参考区间是一项非常重要而花费昂贵的工作。通过采用一些更省钱和更方便的确认程序，把一个实验室的参考区间调用到另一个实验室将是非常有用的方法。随着愈来愈多新的检测项目和方法被实验室引进，要求每个实验室，无论其规模大小，都去研究自己的参考区间是不现实的做法。因此，临床实验室可以越来越多地依赖其它实验室或诊断试剂生产商的帮助，从而在确定参考区间时利用他们提供的适当而足够的参考数据。参考值的调用可能是一件复杂的事情，要达到可以接受需满足某些必要条件。可接受调用的必要条件是因情况而异的：
（1）采用相同（一样）的分析系统（包括方法和仪器）进行检测的参考值的调用。
（a） 在同一个实验室进行调用 （b） 从一个实验室调用到另一个实验室
其中又有两种情形：
? 受试者是来自相同地区和人口统计学意义的群体； ? 受试者是来自不同地区和不同人口统计学意义的群体。
（2）用不同分析系统（不同的方法或不同的仪器）检测分析物，其参考区间调用。
（a）在同一个实验室进行调用 (b)从一个实验室调用到另一个实验室
其中又有两种情形：
? 受试者是来自相同地区和人口统计学意义的群体； ? 受试者是来自不同地区和不同人口统计学意义的群体。
假设原始参考值研究得非常透彻，那么各自进行参考区间的调用就面临者两个主要而突出的问题：即分析系统的可比性和观测群体的可比性。
如果利用临床实验室当前的检测系统，对受试人群某观测物确定的合适参考区间已经存在的话，那么在同一实验室进行改变方法/或仪器后参考区间的调用，就成为两个分析系统的可比性的问题。我们可以参考NCCLS 的EP9文件－《利用病人样本进行的方法比较和偏差评估》，其中描述了实验室工作人员在进行方法学比较和评价的时候应该考虑的程序和因素，大家应该参阅文件的详细内容。一般来说，如果考虑到分析系统有不同的精密度并确定有干扰的话，那么就应该用相同的或有可比性的标准品或者校准品，采用相同的报告单位，这样获得的绝对观测值，就可以说是当前的分析方法与比对方法是可接受的。但是，
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当用NCCLS 的EP9文件指南进行验证后，发现可比性性能评估为不可接受时，那么实验室就必须进行自己的新的参考值的研究。
如果临床实验室希望把其它实验室或诊断试剂生产商采用相同的（或可比性可接受的）分析系统研究建立的参考区间进行调用，这种情况调用的问题就变成了参考人群是否具有可比性了。另外，其他会干扰参考值研究的分析前因素也必须是可比的，比如，参考个体分析前的准备，标本的采集和处理程序等等。实验室进行这一类型的调用日益普遍，此指南可以帮助临床实验室解决许多关于参考区间赋值等问题。
8.2 参考区间的验证
相同（或可比性可接受）的分析系统之间参考区间的调用，主要有三种方法来评估其可接受性。
（1）调用的可接受性，可以通过审查研究原始参考数据时的相关因素来主观地评定。要做到这些，总体中所有参考个体的地区分布和人口统计学情况都必须有详尽的的记述，并且资料可用于评审。分析前和分析中的程序细节、分析的执行过程、整套的原始参考数据以及评估参考区间采用的方法等等，都必须有说明。如果实验室工作人员要参与某些因素的判断，要保证所有接受实验室实验的群体中这些因素的始终一致，那么除拥有描述这些考虑因素的文件外，无需要求接受参考区间的实验室做任何验证研究，参考区间即可调用。
（2）另一种情况是，试剂厂商或其他实验室提供的一组参考区间，用户或接收实验室可能想要或被要求去证实它可被调用。调用的可接受性的评估，可以通过从接收实验室自己的受试者总体中抽出一小组参考个体（大约20例样本即可）,研究自己的小样本和调用的原始的相对较大样本群体的参考值之间的可比性。还要指出的是，原始参考值研究的分析前和分析中各因素控制必须和接收实验室的操作保持一致。如果两组研究对象存在会导致参考区间差异的地理区域或者人口统计学意义上实质性不同，参考区间调用也毫无意义。用于调用验证的参考个体必须是在选择条件上和参考值的获取等方面均要和之前讨论好的指导方针保持一致。这20个人应该合理地代表接收实验室选择的健康总体，并且恰当地满足其排除和分组标准。依照标准的操作规程检验完这20个样本之后，应该审查检验结果是否在统计学上属于同一群体，比方说这些结果中不包含离群值。要检验是否存在离群值，应该采用前面论述的“1/3”规则。任何明显的离群值都应该被弃用，并且代之以新的病例样本以确保20例测试结果不含离群值。
假如20例受试者中不超过2例（或测试结果的10%）的观测值落在起始报告的界限之
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