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文件编号： 元谋县人民医院 葡萄球菌属纸片扩散法药 版本：第一版 微生物室作业指导书 敏试验标准操作规程 生效日期：2011-11-01 共3页 1．目的
规范葡萄球菌属纸片扩散法药敏试验标准操作规程，确保药敏结果的准确。 2. 适用范围
本操作规程适用于葡萄球菌属的细菌。 3. 选药原则
在本规程所列受试抗菌药物主要根据以下因素选择。
3.1 现行版本的CLSI M02和M100对葡萄球菌属细菌纸片扩散法药物敏感试验的要求。 3.2 本单位处方手册中的抗菌药物名册。
3.3 本单位上一年度葡萄球菌属细菌耐药监控数据。 4. 质控
纸片药敏试验应使用金黄色葡萄球菌ATCC25923和大肠埃希菌ATCC35218（用于?内酰胺/?内酰胺抑制剂合剂）进行质量控制，质控菌株可接受的抑菌圈范围参见现行版本的CLSI M100-A19。
5. 材料和仪器
M-H培养基、无菌生理盐水、药敏纸片、无菌棉签、35℃孵育箱、测量尺、标准比浊管或比浊仪。
6．操作步骤
根据CLSI M2-A10和M100-S19制定本操作步骤。
6.1 菌液制备 从孵育了18-24小时的非选择性培养基（如血琼脂）平板上，挑取单个菌落，直接用无菌生理盐水制成悬液作为接种物，将浊度调整至0.5麦氏标准。
应在接种物制备后15分钟内接处M-H琼脂平板。用无菌棉拭蘸取菌液，在管内壁液面上方旋转紧压，将多余菌液挤去，然后在琼脂表面均匀涂片接种3次，每次旋转平板60度以确保接种菌的均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。
6.2 接种好的平板可敞开盖子在室温下干燥3-5分钟（不要超过15分钟），然后用镊子将纸片放入琼脂表面并轻压，使纸片与琼脂表面完全接触。各纸片中心相距应大于24mm，通常150mm平板至多放置12个纸片，90-100 mm平板至多放置6个纸片。由于某些药物在纸片放入琼脂平板后几乎无扩散，所以一旦纸片放入后就不能再移动，若要重新放置，可用 一个新的纸片放在平板的另一位置。
6.3 应在纸片贴好后15分钟内将平板倒置放入35℃孵箱，若超过15分钟将使纸片中的抗生素提早扩散。非苛养菌的药敏解释性标准是建立在这些菌株在空气中孵育的基础上，一些药物（如氨基糖苷类、大环内酯类和四环素）的抑菌圈直径受CO2的影响会有较大的改变，所以本菌属细菌不能孵育在CO2孵箱。 参见《药物敏感性试验标准操作规程》。 7. 判断标准 见表1。
编写：常晓林 2011-09-10
审核：文佳琼 2011-11-11
批准：文佳琼 2011-11-01
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表1 葡萄球菌属细菌纸片扩散试验判断标准
药敏纸片
青霉素（10U） 氨苄西林/舒巴坦（10/10??g） 头孢唑啉（30??g）
判断标准（mm）
敏感 ≥29 ≥15 ≥18 ≥22 ≥25 ≥23 ≥21 ≥14 ≥15 ≥19 ≥16 ≥20 ≥21
中介 12～14 15～17
耐药 ≤28 ≤11 ≤14 ≤21 ≤24 ≤13 ≤14 ≤10 ≤12 ≤13 ≤10 ≤16
备注
参见结果解释9.1、9.3 参见结果解释9.3 参见结果解释9.3 金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌，参见结果解释9.2、9.3 路邓葡萄球菌以外凝固酶阴性葡萄球菌，参见结果解释9.2、9.3
头孢西丁（30??g）
红霉素（15??g）
克林霉素（2??g） 替考拉宁（30??g） 庆大霉素（10??g） 左氧氟沙星（5??g）
复方新诺明（1.25/23.75??g） 利福平（5?g） 利奈唑胺（30??g） 14～22 15～20 11～13 13～14 14～18 11～15 17～19
参见结果解释9.4 参见结果解释9.5
参见结果解释9.6 参见结果解释9.7
8. 注意事项
8.1 抑菌圈直径量取的范围为包括药敏纸片在内的被药物完全抑制的区域（肉眼判断）。药敏平板应置于无反光的黑色背景下，用反射光源肉眼观测。但利奈唑胺和苯唑西林纸片应使用透射光源进行观测。测量区域应为肉眼观察无明显可见菌落生长的区域，忽略只有用放大镜才能观察到的位于抑菌圈外缘的细菌菌落。测量复方磺胺药敏纸片的抑菌圈时，可忽略微弱的生长区域，而从细菌明显生长处量取抑菌圈直径。如苯唑西林、利奈唑胺抑菌圈内任何可辨别的菌落生长，则报告该菌株对相应抗菌药耐药。
8.2 在直接从血平板上挑取菌落配制细菌悬液时需注意，来自血琼脂培养基的菌落可能带有足够的甲氧苄啶或磺胺拮抗物，因此细菌可在甲氧苄啶/磺胺甲唑抑菌圈内部沿着敏感菌株的周围产生模糊生长。
8.3 MRS检测的要点提示：用30??g头孢西丁纸片检测MRS；用直接菌落悬液（DCS）接种法（而不是生长法）；在33-35℃（不超过35℃）、空气中孵育，金黄色葡萄球菌18小时，凝固酶阴性葡萄球菌24小时；用反射光仔细查看抑菌圈，如有任何小菌落或薄膜出现均报告为耐药；如果怀疑可能为MRSA，需用OXA-NaCl筛选试验确认，培养基中必须加NaCl（2%W/V）；MRS必须报告对所有头孢类和其他?内酰胺类抗菌药物均耐药，并提示可能对氨基糖苷类、大环内酯类、克林霉素和四环素等抗菌药物多重耐药；携带mecA基因，或产生PBP2a的葡萄球菌菌株，必须报告为MRS。 9.结果解释
9.1 对于青霉素抑菌圈直径≥29mm的菌株，需要检测该菌株是否产诱导性?内酰胺酶，非产酶菌株才可报告为敏感，见产色素头孢菌素试验标准操作规程。
9.2 头孢西丁纸片代替苯唑西林纸片用于试验，根据头孢西丁的试验结果报告苯唑西林的敏感、中介或耐药。
9.3 青霉素敏感的菌株对所有青霉素类、?内酰胺类/?内酰胺酶抑制剂合剂、头孢菌素、
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碳青霉烯类敏感；青霉素耐药且苯唑西林敏感的菌株对青霉素酶不稳定的青霉素耐药，但对青霉素酶稳定的青霉素类、?内酰胺类/?内酰胺酶抑制剂合剂、相关的头孢菌素、碳青霉烯类仍然敏感；对苯唑西林耐药（MIC法）的菌株应报告对所有的?内酰胺类耐药。
9.4 红霉素耐药、克林霉素敏感的菌株应检测菌株对克林霉素的诱导性耐药性，对克林霉素的诱导耐药性可通过“D”试验进行确认，即将红霉素和克林霉素纸片间隔15-26mm，35℃孵育16-18小时观察结果，如克林霉素抑菌圈在朝向红霉素纸片方向出现“D”变化，该菌株为对克林霉素诱导耐药的菌株，该菌株对克林霉素的药敏结果应修正为耐药。
9.5 葡萄球菌属对糖肽类抗菌药的敏感试验要点提示：纸片扩散试验不能区分对万古霉素敏感菌株（MIC 0.5-2??g/ml）与敏感性下降的菌株（MIC 4-8??g/ml）；须仔细检查MRSA对万古霉素的MIC；可用与肠球菌同样的万古霉素琼脂做筛选试验，在35℃孵育24小时，并同时用阴性质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC29213作对照，用VacC型VRE作阳性对照。阳性结果需用MIC试验确认对VAN的MIC；如出现对万古霉素敏感性下降的菌株（MIC≥4?g/ml），应该重复鉴定和药敏试验，并保留菌种，送参考实验室确认；如果实验室用自动分析仪做万古霉素的敏感试验，必须加做CLSI推荐的BHI-万古霉素（6?g/ml）琼脂筛选试验，或用CLSI参考方法或E试验测定MIC；替考拉宁纸片扩散试验折点对于将替考拉宁敏感菌株从替考拉宁耐药或中介的菌株中鉴别出来的能力尚待进一步的评估。 9.6 利福平不能单独用于抗感染治疗。
9.7 利奈唑胺纸片的抑菌圈应用透视光量取，如出现利奈唑胺不敏感的菌株，应用MIC法进行确认。
参考文献
[1] CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Nineteenth Informational Supplement.CLSI document M100-S19.Wayne,PA:Clinical and Laboratory Standards Institute,2009
[2] 叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第3版.南京：东南formn大学出版社，2006
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文件编号： 元谋县人民医院 肠球菌属纸片扩散法药敏 版本：第一版 微生物室作业指导书 试验标准操作规程 生效日期：2011-11-01 共2页
1．目的
规范肠球菌属纸片扩散法药敏试验标准操作规程，确保药敏结果的准确。 2. 适用范围
本操作规程适用于肠球菌属细菌。 3. 选药原则
在本规程所列受试抗菌药物主要根据以下因素选择。
3.1 现行版本的CLSI M02和M100对肠球菌属细菌纸片扩散法药物敏感试验的要求。 3.2 本单位处方手册中的抗菌药物名册。
3.3 本单位上一年度肠球菌属细菌耐药监控数据。 4. 质控
纸片药敏试验应使用金黄色葡萄球菌ATCC25923进行质量控制，质控菌株可接受的抑菌圈范围参见现行版本的CLSI M100-A19。 5. 材料和仪器
M-H培养基、无菌生理盐水、药敏纸片、无菌棉签、35℃孵育箱、测量尺、标准比浊管或比浊仪。
6．操作步骤
参见《药物敏感性试验标准操作规程》。 7. 判断标准 见表1。
表1 肠球菌属细菌纸片扩散试验判断标准
药敏纸片
氨苄西林（10??g） 万古霉素（30??g） 替考拉宁（30??g） 庆大霉素（120??g） 左氧氟沙星（5??g） 呋喃妥因（300??g） 利奈唑胺（30??g） 磷霉素（200??g） 氯霉素（30??g）
判断标准（mm）
敏感 ≥17 ≥17 ≥14 ≥10 ≥17 ≥17 ≥23 ≥16 ≥18
中介 15～16 11～13 14～16 15～16 21～22 13～15 13～17
耐药 ≤16 ≤14 ≤10 ≤6 ≤13 ≤14 ≤20 ≤12 ≤12
备注
参见结果解释9.1、9.2 参见结果解释9.3
参见结果解释9.4、9.5
8. 注意事项
8.1 抑菌圈直径量取的范围为包括药敏纸片在内的被药物完全抑制的区域（肉眼判断）。药敏平板应置于无反光的黑色背景下，用反射光源肉眼观测。但万古霉素的抑菌圈应该用透射光源量取。测量区域应为肉眼观察无明显可见菌落生长的区域，忽略只有用放大镜才能观察到的位于抑菌圈外缘的细菌菌落。如在抑菌圈内任何可辨别的菌落生长，则报告该菌株对万古霉素耐药。
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8.2 对肠球菌属细菌而言，头孢菌素、氨基糖苷类（高浓度除外）、克林霉素和复方新诺明体外药敏试验结果可能敏感，但临床治疗无效，因此不报告为敏感。 9.结果解释
9.1 氨苄西林的药物敏感试验结果可代表细菌对氨苄西林和阿莫西林的敏感性。在非产酶的肠球菌中，氨苄西林敏感提示菌株对阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林-舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦敏感。
9.2 纸片扩散法和稀释法均无法准确判断菌株是否由于产?内酰胺酶而引起氨苄西林和青霉素的耐药性，因此对于从血液和脑脊液分离的菌株需要用头孢噻吩进行检测菌株是否产?内酰胺酶，见产色素头孢菌素试验标准操作规程。
9.3 在进行肠球菌的万古霉素药物敏感试验时，药敏平板孵育要足24小时，须用透视光源量取抑菌圈直径，对于万古霉素中介的肠球菌应用MIC进行检测，有关耐万古霉素肠球菌的检测参见《耐万古霉素肠球菌筛选试验标准操作规程》。
9.4 氨苄西林、青霉素或万古霉素与一种氨基糖苷类抗菌药联合用药需要先进行菌株对高浓度氨基糖苷类的药物敏感试验（庆大霉素和链霉素），其他氨基糖苷类抗菌药的效果并不比这两种更好，因此无需检测。
9.5 敏感提示可以与细胞壁活性的抗菌药（如氨苄西林、青霉素和万古霉素等）抗菌药联合使用，7-9mm为不确定，应进行琼脂稀释法或肉汤稀释法进行确认，耐药表明不能与细胞壁活性抗菌药联合使用。
参考文献
[1] CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Nineteenth Informational Supplement.CLSI document M100-S19.Wayne,PA:Clinical and Laboratory Standards Institute,2009
[2] 叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第3版.南京：东南formn大学出版社，2006
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