南京林业大学 本科毕业设计（论文）
题 目：
石竹属DNA指纹图谱构建
目录
1 文献综述 ..................................................................................................................................... 1
1.1 DNA指纹图谱 .................................................................................................................. 1 1.2石竹属生物学背景 ............................................................................................................ 1 1.3国内外研究进展 ................................................................................................................ 2 1.4分子标记种类及发展历程 ................................................................................................ 2
1.4.1 SRAP标记 ............................................................................................................... 3 1.4.2 ISSR标记 ................................................................................................................ 4 1.5 研究目的及意义 ............................................................................................................... 6 2 材料与方法 ................................................................................................................................. 7
2.1材料来源 ............................................................................................................................ 7 2.2 DNA提取与纯化 .............................................................................................................. 8
2.2.1 试剂配置 ................................................................................................................. 8 2.2.2实验步骤 .................................................................................................................. 8 2.3 PCR反应正交设计 ........................................................................................................... 9
2.3.1 SRAP-PCR反应 ...................................................................................................... 9 2.3.2 ISSR-PCR反应........................................................................................................ 9 2.4 实验方法 ......................................................................................................................... 10
2.4.1 引物来源 ............................................................................................................... 10 2.4.2 SRAP-PCR实验 .................................................................................................... 10 2.4.3 ISSR-PCR实验...................................................................................................... 11 2.5 电泳检测 ......................................................................................................................... 11 2.6 位点统计方法 ................................................................................................................. 12 3 结果与分析 ............................................................................................................................... 13
3.1正交实验结果与分析 ...................................................................................................... 13
3.1.1 SRAP-PCR反应 .................................................................................................... 13 3.1.2 ISSR-PCR反应...................................................................................................... 14 3.2指纹图谱建立 .................................................................................................................. 15
3.2.1 SRAP指纹图谱 ..................................................................................................... 15 3.2.2 ISSR指纹图谱 ...................................................................................................... 16
4 讨论 ........................................................................................................................................... 17
4.1 分子标记的体系优化 ..................................................................................................... 17 4.2指纹图谱构建 .................................................................................................................. 17 致谢 ............................................................................................................................................... 18 参考文献 ....................................................................................................................................... 19
摘要
本研究利用ISSR和SRAP分子标记，对在新疆收集的石竹属植物资源进行了种间指纹图谱分子构建。结果如下：
通过正交设计对两种分子标记进行体系的优化实验，得到稳定可靠的反应体系。SRAP优化体系为Mg2+2.5mmol/L、dNTP 0.25mmol/L、引物0.25μmol/L、Taq酶为1.0U。ISSR优化体系为Mg2+1.25mmol/L、dNTP 0.425mmol/L、引物0.8μmol/L、Taq酶为0.5U。
利用SRAP和ISSR分子标记对石竹属10个种的DNA（各8-9个个体建立的DNA池）分析，成功构建了石竹属植物的指纹图谱。其中，SRAP分子标记需要4对引物的组合可以将10个种鉴别出来， 而ISSR分子标记则需要5对引物的组合，这进一步验证了SRAP标记用于构建植物种间指纹图谱的可行性和优越性。
关键字：石竹，正交设计，指纹图谱
Abstract
In this study, ISSR and SRAP molecular markers was used to construct interspecific fingerprint of the genus Dianthus which collected in Xinjiang. The results are as follows:
The system of the molecular markers was both executed the optimization experiments by orthogonal, and we could have a steady and reliable response system. The SRAP optimization system was Mg2 +2.5 mmol / L, dNTP 0.25mmol / L, primer 0.25μmol / L, Taq enzyme 1.0U. The ISSR optimization system was Mg2 +1.25 mmol / L, dNTP 0.425mmol / L, primer 0.8μmol / L, Taq enzyme 0.5U.
The fingerprint of the genus Dianthus was constructed successfully by using SRAP and ISSR molecular markers to analysis the 10 species of Dianthus DNA (each DNA pool established by 8-9 individuals). Which, SRAP markers need 4 combinations of primers to identify 10 species, and ISSR molecular markers requires a combination of 5 pairs of primers. This was further validated that the SRAP marker has feasibility and superiority in building fingerprint of plant species.
Key Words：Dianthus, Orthogonal design, Fingerprint
1 文献综述
1.1 DNA指纹图谱
遗传标记在遗传学的建立和发展过程中有着举足轻重的作用，同时它也是作物遗传育种的重要的工具。随着遗传学的进一步发展和分子生物学的异军突起，遗传标记先后相应地经历了形态标记、细胞学标记、生化标记和DNA分子标记四个发展阶段。前三种标记都是基因表达的结果为基础的，是对基因的间接反映；而DNA分子标记则是DNA水平遗传变异的直接反映，它具有能对各个发育时期的个体、各个组织、器官甚至细胞作出“中性”以及操作简便等特点。正是这些特点，奠定了它极其广泛的应用基础。DNA分子标记本质上是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异特DNA片段。DNA分子标记大多以电泳谱带的形式表现生物个体之间DNA差异，通常也称为DNA的指纹图谱。目前指纹图谱构建已广泛应用，构建指纹图谱的方法有多种,都分别从不同的角度反映了作物的遗传信息[1~6]如：利用ISSR标记构建红花檵木品种指纹图谱[7]。还有利用SSR，AFLP标记技术对甘肃地方核桃种质资源遗传多样性分析[8]。除此以外已构建了水稻、番茄、棉花等30多种植物的遗传图谱。
由于DNA指纹图谱的高度特异性和稳定性，世界各国目前已经在罪犯的确认、血清鉴定、确定遇难者身份方面广泛使用这种技术。例如，在“9.11”恐怖袭击事件中，几千名遇难者的尸体支离破碎，科学家便利用DNA指纹技术鉴别死者身份。除此，可以利用DNA指纹技术可以检测不同物种。同种及同种不同个体的亲缘关系，也可以进行物种分类鉴定、起源进化的研究。目前，DNA指纹技术凭借自身技术简单、准确、快速等优点。在植物品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。
1.2石竹属生物学背景
石竹属(Dianthus L.)为石竹科(Caryophyllaceae)一、二年生或多年生草本。全球约有600余种，广布于北温带，主要分布于欧亚大陆，尤其是地中海地区，少数产北美和北非。我国石竹属依据花簇生、单生或成疏聚伞花序、花梗长短、花瓣齿裂或繸裂等形态特征分为4组，即簇花组sect.Carthusianum Williams， 齿瓣组sect.Barbulatum Williams，石竹组sect.Dianthus和繸裂组 sect.Fimbriatum Williams。石竹属(Dianthus L.)植物为重要的花卉
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品种资源，有不少栽培种类,是很好的观赏花卉,其中香石竹(Dianthus caryophyllus)，又名康乃馨(Carnation)，为世界四大鲜切花之一[9]，是风靡全球的著名花卉。
1.3国内外研究进展
在石竹属中，由于香石竹是是目前世界上应用最普遍的花卉之一，所以国内外对其都进行了深入的研究。香石竹别名康乃馨，我国上海于1910年开始引种生产，目前品种在100种以上,但无自己培育的品种。栽培的主要品种有独头品种（红花品种，玫瑰红品种，粉色品种，白花品种，黄色品种，杂色品种）、小花品种和多头品种[9]。在转基因研究方面，蔡友铭等利用RAPD标记分析了中国石竹属10个种和10个栽培品种，并讨论了种间及品种间的亲缘关系[10]。余义勋[11]等通过将香石竹ACC氧化酶基因构建为表达载体，再导入根癌农杆菌LBA4404菌株,并转化香石竹品种Master、爱卡迪幼叶,经PCR检测和Southern杂交鉴定,获得了8株转化植珠。还有何秋伶等在建立香石竹叶片离体培养再生体系的基础上,将双价抗病基因构建在同一个植物表达载体上，增强香石竹抗病性 [12]。
1.4分子标记种类及发展历程
广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义的分子标记概念就是指DNA标记,而这个界定现在被广泛采纳。在过去10多年中，分子标记技术得到了突飞猛进的发展，至今已有几十种分子标记技术相继出现，并在作物遗传育种、基因组作图、基因定位、植物亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等各个研究领域得到了广泛的应用。DNA标一记主要包括三大类，分别为[13]:一、基于DNA分子杂交的DNA标记。如:RFLP二、基于PCR技术的DNA扩增方法。如:RAPD、三、基于DNA序列和芯片的分子标记。如:SNP它们也可以分别被称为第一代，第二代和第三代分子标记。其中第二类基于PCR技术的DNA扩增方法，又分为3类:1.使用随机引物和利用特定引物或成对引物扩增的标记。如:RAPD、ISSR。2.使用PCR与酶切相结合的方法。如:AFLP。3.利用反转录转座子的分子标记。如:IRAP、REMAP
分子标记自80年代初有人提出用RFLP作为遗传标记构建遗传连锁图谱的设想，以及自80年代中期PCR技术诞生以来迄今为止已发展了许多种基于DNA多态性的分子标记技术，有的已广泛地应用于遗传学研究的各个领域[14]
主要的分子标记技术包括RFLP(限制性片段长度多态性)、RAPD(随机扩增多态性
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