2.2 DNA提取与纯化
2.2.1 试剂配置
（1）CTAB提取液配制（500ml）：称取10gCTAB、40.908克NaCl、25克PVP于500ml烧杯中，加入约300mlddH2O磁力搅拌溶解，直至完全透明；量取20mlEDTA(0.5mol/L，pH=8.0)、50mlTris-HCl(1mol/L，pH=8.0)溶液于烧杯中混合均匀；定容至500ml，高温高压灭菌后，室温保存。
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（2）0.5mol/L EDTA溶液配制（500ml）：称取93.06EDTANa2.2H2O于500ml烧杯中；加入约400ml ddH2O，用固体NaOH（约10g）慢慢调pH至接近8，磁力搅拌至完全溶解，再用稀的NaOH溶液调pH至8；定容至500ml，高温高压灭菌后，室温保存。
（3）100mmol/L Tris-HCl溶液配制（500ml）：称取6.05gTris于500ml烧杯中；加入约400mlddH2O；用浓HCl调pH至6.4（约需3-6 ml）；定容至500ml后，用棕色瓶分装，保存于4℃冰箱（如有沉淀，水浴加热溶解即可）。
（4）硅珠悬浮液配制：称取1.2g硅珠溶于10ml无菌水中，存于4℃冰箱，使用时先涡旋，使其混合均匀。
（5）漂洗液配制：称取120g异硫氰酸胍（GuSCN），再加入100ml Tris-HCl溶液（100mmol/L，pH=6.4），在60℃水浴中溶解。
（6）无水乙醇 （7）70%乙醇
2.2.2实验步骤
采用改进的CTAB裂解-硅珠吸附法[29]从新鲜的叶片中提取总DNA，具体步骤如下： (1) 在10mlEP管中加人4mlCTAB提取液及80μl琉基乙醇在65℃水浴锅中预热； (2) 取植物材料1-2g，适量液氮研磨成粉末后加人预热的CTAB提取液，充分摇匀后于65℃水浴中30 min；
(3) 将样品置于冰上迅速冷却至室温，加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），充分混匀后12000rpm离心10min，取上清液lml于1.5ml离心管中（其余上清液于-20℃保存备用）； (4) 加入100μl硅珠悬浮液（l.2g硅珠粉末溶解于10ml无菌水），利用旋涡震荡器震荡（大约15s），使之充分混匀，于室温静止l0 min后震荡5s，8000rpm离心15s，去上清液得到硅珠一核酸复合物；
(5) 将复合物充分涡旋使之完全分散，加人1ml漂洗液（GuSCN 120g溶解于100ml，100mmol/l Tris-HCl缓冲液中，pH=6.4），充分混匀后8000rpm离心15s，弃上清； (6) 重复步骤5一次；
(7) 用70%无水乙醇将硅珠一核酸复合物漂洗两次，最后用无水乙醇漂洗一次后，真空干燥复合物；
(8) 加入100ulTE缓冲液充分混匀后，于56℃水浴保温10min，14000rpm离心10min，取上清液即为所需的DNA溶液。
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2.3 PCR反应正交设计
2.3.1 SRAP-PCR反应
针对影响PCR反应的Mg2+、dNTPs、引物和Taq聚合酶4个因素，选用L9(34)在3水平上进行实验。使用的引物组合为Me6/Em1。以下每步骤中处理均重复3次。总反应体积为10μl。L9(34)设计表见表4
表4 SRAP-PCR反应体系的正交试验设计L9(34)
组合编号
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Mg2+(mmol/L)
1.5 1.5 1.5 2.0 2.0 2.0 2.5 2.5 2.5
引物(μmol/L)
0.15 0.25 0.35 0.15 0.25 0.35 0.15 0.25 0.35
Taq酶（U/L）
0.5 1.0 1.5 1.0 1.5 0.5 1.5 0.5 1.0
dNTP（mmol/L）
0.15 0.20 0.25 0.25 0.15 0.20 0.20 0.25 0.15
2.3.2 ISSR-PCR反应
针对影响PCR反应的Mg2+、dNTPs、引物和Taq聚合酶4个因素，选用L9(34)在3水平上进行实验。使用的引物编号为855。总反应体积为10μl。L9(34)设计表见表5
表5 ISSR-PCR反应体系正交试验设计表L9(34)
组合编号
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Mg2+(mmol/L)
1.25 1.25 1.25 1.75 1.75 1.75 2.25 2.25 2.25
引物(μmol/L)
0.4 0.6 0.8 0.4 0.6 0.8 0.4 0.6 0.8
9
Taq酶（U/L）
0.5 1.0 1.5 1.0 1.5 0.5 1.5 0.5 1.0
dNTP（mmol/L）
0.325 0.375 0.425 0.425 0.325 0.375 0.375 0.425 0.325
2.4 实验方法
2.4.1 引物来源
SRAP引物设计参考Li等的方法， ISSR引物设计参照加拿大哥伦比亚大学网站公布的序列，见表6，表7。所使用的引物是由上海英骏生物技术有限公司合成的。
表6 SRAP引物编号
Table5 SRAP primer number
编号
Em1 Em8 Em9 Em10 Em12 Em14
序列
GACTGCGTACG AATT AAT GACTGCGTACG AATT TGC GACTGCGTACG AATT TCA GACTGCGTACG AATT TCG GACTGCGTACG AATT CAT GACTGCGTACG AATT CAG
编号
Me3 Me8 Me9 Me12 Me13
序列
TGAGTCCAAA CCGG AAC TGAGTCCAAA CCGG ACC TGAGTCCAAA CCGG ACG TGAGTCCAAA CCGG AGG TGAGTCCAAA CCGG TAG
表7 ISSR引物编号
Table6 ISSR primer number 编号 826 855 864
引物序列
ACA CAC ACA CAC ACA CC ACA CAC ACA CAC ACA CYT ATG ATG ATG ATG ATG ATG
编号 827 855 868
引物序列
ACA CAC ACA CAC ACA CG ACA CAC ACA CAC ACA CYT GAA GAA GAA GAA GAA GAA
2.4.2 SRAP-PCR实验
⑴ 反应体系
DNA： 1 μl （30ng/μl） Buffer： 1 μl
MgCl2： 0.1μl （25 mM） dNTP： 0.1μl （2.5 mM） Primer-1： 0.5μl （5μmol/） Primer-2： 0.5μl （5μmol/） Taq： 0.2μl （5U/μl） ddH2O： 6.6ul 反应总体积：10μl ⑵ 扩增程序
94℃预变性5min；94℃变性1min、35℃复性1min、72℃延伸1.5min,5个循环；94℃
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变性1min、50℃复性1min、72℃延伸1.5min，35个循环，72℃延伸8min，4℃保存。
2.4.3 ISSR-PCR实验
⑴ 反应体系
DNA： 2 μl （30ng/μl） Buffer： 2 μl
MgCl2： 1μl （25 mM） dNTP： 3.4μl （2.5 mM） Primer-1： 1.6μl （10μmol） Taq： 0.2ul （5U/μl） ddH2O： 9.8μl
反应总体积：20μl ⑵ 扩增程序
94℃预变性3min；94℃变性30s；58℃复性45s；72℃延伸2min；接着梯度降温（1℃/cycle）进行复性，5个循环后稳定在53℃，再进行30个循环；72℃延伸8min；4℃保存。
2.5 电泳检测
ISSR琼脂糖凝胶检测
PCR反应结束后，吸取9μl PCR产物与5ul上样缓冲液（0.25%嗅酚兰，15%聚蔗糖），充分混匀。配置1.5%琼脂糖胶，吸取10ul混合液点样在胶孔中，150v，100mA，电泳25分钟；置于紫外光下，凝胶成像系统拍照。
SRAP聚丙烯酰胺凝胶检测
在反应结束后加入5μl上样缓冲液（0.25%溴酚兰，15％聚蔗糖），充分混匀。灌制8%变性聚丙烯酰胺凝胶。取混合液点在凝胶梳孔里，180V恒电压电泳2小时，直到溴酚兰跑出凝胶。取下胶银染，拍照。
电泳槽：BIO-RAD垂直电泳槽（PROTEAN Ⅱ Xi Cell and PROTEAN ⅡXi 2-D Cell） 8%胶配方：4.2g尿素，2ml 40%胶（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=39：1），1ml 10×TBE加水至10ml，最后加入180ulAPS（10%过硫酸氨）和35ulTEMED（N、N、N’N’-四甲基乙二胺）。在配制40%的胶时，按39：1的质量比称取丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺，然后用双蒸水溶解、过滤定容。
Marker：100bp ladder 银染步骤：
1）取下带胶的玻璃板后，用双蒸水冲洗；
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2）固定10分钟（10%乙醇100ml+0.5ml纯乙酸）； 3）用去离子水洗两次；
4）加入事先配好的AgNO3，银染8分钟（AgNO3最终浓度约为0.15%）； 5）用去离子水洗两次，洗掉残留AgNO3；
6）倒入显影液（配100ml需加1.5gNaOH + 1ml0.756%的四硼酸钠+0.75ml甲醛）直到显出清晰的条带，去离子水冲洗一次即可拍照。
固定，银染，显影步骤在摇床上进行。
2.6 位点统计方法
根据每对引物生成带型间的差别直接对带型进行分类编号，可得到每个种的带型编号。一个种的DNA经过不同引物扩增后，将获得一系列带型编号，按照固定的引物序列，串联各带型编号,形成一组数据。将这些图谱转换为由 1 和0 组成的字串，构成数字指纹图谱。
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