DNA)、AFLP（扩增片段长度多态性）、SSR（简单序列重复）、ISSR（重复序列间扩增）、SRAP（相关序列扩增多态性）等。RFLP标记法是目前使用较为广泛的一种标记技术。与传统的遗传标记相比，RFLP标记具有许多优点，诸如，标记源于基因组DNA自身的变异，如突变、易位和倒位等，其标记数量较大；无表现型效应，检测不受环境条件和发育阶段的影响；呈简单的共显性遗传，也不受杂交组合方式的影响等。该技术特别适合构建遗传连锁图谱。RARD标记法以人工合成的随机核苷酸序列为引物，以基因组总DNA为模板的标记技术。其特点是 ①所需引物短,且可随机设计；②没有种属特异性，合成一套引物可以用于不同基因组的分析；③所需DNA用量少，操作程序简便快速，无需制备克隆、同位素标记及分子杂交等。缺点是每个标记提供的信息量少，重复性差等。AFLP标记法是通过DNA多聚酶链式反应(PCR)扩增基因组DNA的模板而产生。其优点有①所需DNA用量少；②技术能够获得更高的信息量③不需要预先知道扩增基因组的序列特征等信息。尽管AFLP技术具有很多优点，但也存在一些缺点,主要表现在以下方面：①所需仪器和药品价格昂贵,实验成本较高；②操作复杂，对实验人员的技术水平要求较高。该技术已应用于小麦、水稻、玉米、大豆和棉花等主要农作物[13]。SSR标记法是指以少数几个核苷酸（1～4个）为单位多次串联重复的DNA序列，分布于常染色质区，是真核生物基因组重复序列的主要组成部分，广泛分布于基因组中。SSR广泛存在，并且进化变异速度非常快，使得能够检测到全基因组中多位点的变异，多态性较高。而缺点是需要预知靶标序列，技术难度较高。本次石竹属DNA指纹图谱由有ISSR、SRAP两种分子标记共同构建的。
1.4.1 SRAP标记
SRAP分子标记技术首先是由美国加州大学蔬菜作物系Li与Quiros[15]于2001年在研究芸薹属作物时开发出来的。它独特的引物设计可检测基因的阅读框(ORFs)区域，是一种不需要任何序列信息即可直接进行PCR扩增的新型分子标记技术。
SRAP技术的基本原理是通过扩增一对引物对可阅读框进行的。其中正向引物长17 bp，5’端核心序列由10 bp无任何特异的填充序列(一般是TGAGTCCAAA，少数为TGAGTCCTTT)和CCGG组成,随后为3’端的选择性碱基，正向引物对外显子进行扩增。反向引物的组成与正向引物类似，区别在于反向引物长18 bp，核心序列由11 bp填充序列(GACTGCGTACG)和特异序列AATT组成，3’端仍为3个选择性碱基，反向引物对内含子区域和启动子区域进行扩增。因内含子、启动子和间隔序列在不同物种甚至不同个体间差异很大，从而可以与正向引物搭配扩增出基于内含子和外显子的SRAP多态性标记。SRAP
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标记系统引物设计的一般原则(如：不能有二聚体、发卡结构、GC含量为40% ~60%等)外，还有其独特之处。它针对基因组可阅读框的一些特点而设计，利用在不同个体中外显子的相对保守性及内含子和启动子的可变性，通过正反引物的组合搭配扩增出基于内含子与外显子的多态性标记。SRAP自诞生以来，以其操作简便快速、成本低、可信度高、易于测序等特点倍受分子生物学家的青睐。在遗传多样性研究方面，SRAP标记比其他标记具有更突出的优点，因此较多的研究者开始运用SRAP标记进行物种遗传，Ferriol等[16]对甜瓜(Cu-curbita pepo)的2个变种69份变异类型材料进行遗传多样性分析，利用SRAP和AFLP两种分子标记和形态学分析，结果表明：分子标记手段与形态学分析存在一致的方面，除此，分子手段提供的信息更加详细，而且SRAP标记更优良。另外，Fufa[17]等运用SRAP对硬红冬小麦进行了基因型比较和分类研究,结果表明：23对SRAP引物产生共产生了468条条带，其中有6条为非多态性条带，遗传多样性在0. 1~0. 9，平均为0. 418，试验可证明， SRAP在遗传多样性和基因型鉴定上有很好的应用前景。Budak等[18]以野牛草为材料比较了RAPD、SSR、ISSR和SRAP 4种分子标记技术的优越性，发现SRAP具有最丰富的多态性和最强的区分能力。王从彦等[13]对芫花的研究亦表明，SRAP是研究遗传多样性、品种鉴定和系统发生的有效的工具。除此以外在油茶Camellia oleiferaAbel.[19]、荔枝Litchi chinen-sisSonn.[20]、落羽杉
Taxodium distichum(L.)Rich.[21]、构树
Broussonetia
papyrifera( L.)Vent.[22]、桃Prunus persica(L.)Batsch[23] 等物种的分子鉴别、遗传多样性分析等方面SRAP标记法也得到广泛应用。
1.4.2 ISSR标记
ISSR(inter-simple sequence repeat)又称简单重复序列间扩增，是在SSR基础上发展起来的一类新型的分子标记技术，其引物开发费用低，具有操作简单，目前，ISSR标记已广泛地用于遗传作图品种鉴定、遗传多样性、基因定位、系统发育、分子标记育种等方面。植物基因组中散布有大量的DNA重复序列，根据其在基因组中的含量可分为轻度、中度和高度重复序列，根据其分布特征可分为散重复序列和串联重复序列，SSR是一种分布于常染色质区的高度串联重复序列，重复序列为2～6bp，是真核生物基因组重复序列的主要组成部分，均匀分布于基因组中,正是基于基因组的这种特点，才出现了SSR和ISSR分子标记技术。
ISSR是基于SSR发展起来的一种新型分子标记技术，它的基本原理就是在SSR的3’端或5’端加锚1～4个嘌呤或嘧啶碱基，并以此作为引物，通常为16～18个碱基序列，对
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两侧具有反向排列SSR的一段DNA序列进行扩增，然后再进行电泳、染色，根据谱带的有无及相对位置，来分析不同样品间ISSR标记的多态性。此外，ISSR技术除了引物设计要求不同外，原理和操作与SSR、RAPD非常相似，但其产物多态性远比RFLP、SSR、RAPD更加丰富，可以提供更多的关于基因组的信息。ISSR标记结合了RAPD和SSR的优点，具有模板需要量少、多态性丰富，无需试剂盒、结果记录方便、实验成本低、操作简单、实验稳定性较高等优点。但有PCR扩增时也有最适反应条件，因此需要一定时间摸索，其标记大多为显性标记。在解决交配系统、计算杂合度和父系分析等问题时效果不佳。引物设计是ISSR技术中最关键、最重要的一步。在选择ISSR引物时，应以二核苷酸重复序列为主，少选寡聚三核苷酸、四核苷酸引物；此外，尽管ISSR引物为通用引物，不像SSR引物那样需根据物种基因组特征合成引物，但研究中仍发现不同植物类群中,能够扩增出带纹的引物存在较大差异[24]。
ISSR分子标记目前已在植物遗传多样性分析中广泛应用，如对百里香属植物地椒(T. quinque-costatusCelak.)地椒的亚洲变种〔T. quinquecostatusvar.asiaticus(Kitagawa) C. Y. Wu etY. C. Huang〕和百里香(T. mongolicusRonn. )15个居群的总DNA进行了ISSR和SRAP初步分析，以9条ISSR引物共扩增出88条清晰条带,扩增片段长度多集中在300～1 500 bp,平均每个引物的扩增条带数为9.8条,多态性条带总数为77条,多态性条带百分率达到87. 5%。7对SRAP引物共扩增出97条清晰条带,扩增片段长度多集中在150～250 bp,平均每对引物的扩增条带数为13.9条,多态性条带总数为72条,多态性条带百分率为74.2%[25]。牟海飞[26]等利用ISSR分子标记技术对威廉斯B6及其选育亲本等国内外32个香蕉品种(系)的遗传多态性进行分析。从98对通用ISSR引物中筛选出7对多态性引物,共扩增出64条DNA带,其中51条为多态性带,多态性比例为79. 69%,平均每个引物扩增的DNA带数为9. 12条。供试香蕉品种间的遗传相异系数范围为0.0345~0. 7500,平均相对遗传相异系数为0. 03051。聚类分析结果表明,所有供试的32个香蕉品种(系)可分为四个类群,其中巴引103、野酸蕉和花蕉(观赏)分别为一类,其余29个品种(系)聚为一类。从电泳图上可以看出,香蕉32个品种(系)的ISSR扩增产物电泳图的条带清晰,多态性较好,显示出较好的遗传多样性
[27]
。
还有刘永财[28]等利用ISSR标记对15份新麦草(Psathyrostachys juncea)种质资源进行遗
传多样性检测。为获得稳定的新麦草ISSR反应体系,对反应条件中的dNTP、Taq酶浓度、引物浓度、Mg2+浓度等因子进行了优化,建立起的最佳反应体系为:25μL的反应体系中含有dNTP 2.5μL、Taq酶0.2μL、Primers 1μL、Mg2+1.5μL、2.5μL 10×Buffer、2μL模板DNA和
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ddH2O 15·3μL。ISSR标记结果显示,筛选出的重复性好、谱带清晰的ISSR引物8条,共获得84个扩增位点,其中多态性位点72个,多态性比率(PPB)为85.7%。通过遗传相似系数(GS)的计算,供试种质材料间的GS值在0·4405~0·9048之间,表现出丰富的遗传多样性。研究表明，ISSR是一种有效的、理想的揭示材料间遗传差异的分子标记，因而在遗传多样性研究方面具有广泛的应用前景。
1.5 研究目的及意义
本研究通过PCR反应体系优化、引物筛选，最终建立一套适合于石竹DNA指纹构建的SRAP、ISSR技术体系。并利用多态性丰富的引物进行指纹图谱分析，通过软件处理，构建10个石竹种的标准指纹图谱，此图谱的构建，一方面，为今后石竹属种间鉴定提供快速、科学的参照标准。另一方面，也为香石竹（康乃馨）杂交育种提供亲缘关系的遗传背景材料。除此，在此图谱的基础上，也可以进行石竹属种间及种内遗传多样性方面的研究。
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2 材料与方法
2.1材料来源
从新疆乌鲁木齐、木垒、霍城、尼勒克、唐布拉、阿尔泰、布尔津、小东沟、庙儿沟等地采集野生石竹的种子，共计 10个种，种名分别是针叶石竹、多分枝石竹、兴安石竹、瞿麦、高石竹、准噶尔石竹、天山石竹、繸裂石竹、长萼石竹、大苞石竹。选取较成熟饱满的种子进行组织培养，将种子经过消毒，在超净工作台中用75%的酒精浸泡30s，无菌水冲洗2次后放入0.01%Hgcl2 7min，无菌水冲洗3次。之后将消毒好的种子接到MS基本培养基中，每瓶中接种4-6粒种子，1周左右种子开始萌芽，20d之后第一次继代。将已萌芽的幼苗分成单株，接到分化培养基中进行壮苗，嫩芽迅速生长，20d左右苗高3～4cm。每30d继代一次。分化培养基：MS+6-BA(1.0mg/l)，培养温度为：25-27℃，光照时间每天12小时。
选取瞿麦4个DNA进行两种分子标记的体系优化实验，材料编号记作1号、2号、3号、4号。指纹图谱构建实验中，取样方式选择混合DNA池法，将具有某一共同特征群体的部分个体DNA提取后，经过定量和稀释成一定浓度、按比例或等量混合构成一个池。有二样品（由两个个体的DNA构成）、多样品池（由7~9个个体的DNA构成），本实验中构成的是多样品池，每个种的取样株树在7~9株，取样明细见表1。
表1 混合DNA池构成
Table1 Consititue a pool of mixed DNA
种 名
针叶石竹(D. acicularis) 多分枝石竹(D. ramosissimus) 兴安石竹(D. versicolor) 瞿麦(D. superbus) 高石竹(D. elatus.)
准噶尔石竹(D. soongoricus) 天山石竹(D.tianschanicus) 繸裂石竹(D. orientalis ) 长萼石竹(D. kuschakewicizii) 大苞石竹(D. hoeltzeri)
混合DNA池株系数量
7株 8株 7株 8株 9株 8株 8株 7株 8株 9株
材料编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
合计：10种
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