3 结果与分析
3.1正交实验结果与分析
3.1.1 SRAP-PCR反应
SRAP-PCR反应时选取Me6/Em1作为扩增引物，以同一个种不同家系的4个DNA进行扩增，电泳图如图2。
500bp 400bp
200bp 100bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
图2 SRAP-PCR产物电泳图
根据电泳图3所示，参照何正文等[30]的方法，依扩增条带的亮、特异性多带数量以及杂带的数目，将各处理的结果做1~9分记分。条带数量丰富、清晰度高和背景低的最佳产物记为9分，与此相反，最差的记为1分，因此1到9个组合的分数依次为1分、3分 、4分、6分、8分、2分、5分、9分、7分。 每个因素同一水平下的数值之和越大，该水平就越好；极差越大，该因素对反应体系的影响越显著。由表2可知，在选定的3个水平范围内，SRAP-PCR反应中，对反应影响最大的是Mg2+,引物，之后dNTP,最后是Taq酶。4个组分的最佳反应水平为：Mg2+2.5mmol/L、dNTP 0.25mmol/L、引物0.25μmol/L、Taq酶为1.0U。与此一致的组合并没有在正交表中出现，但与分值最高的8号组合很接近。ISSR反应体系的正交试验设计极差分析见表6。
表6 SRAP反应体系的正交试验设计极差分析 Table6 SRAP reaction range analysis of orthogonal test design
编号 K1 K2 K3
Mg2+ 8 16 21
引物 12 20 13
13
Taq酶 12 16 17
dNTP 16 10 19
?K1 ?K2 ?K3 R0
2.67 5.33 7 4.33
4 6.67 4.33 2.67
4 5.33 5.67 1.67
5.33 3.33 6.33 3.00
注：K为各列各水平的和；?K为各水平的均值；R0为极差。
3.1.2 ISSR-PCR反应
ISSR-PCR反应时选取855作为扩增引物，以同一个种不同家系的4个DNA进行扩增，电泳图如图3。
1500bp 500bp 1500bp 500bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
图3 ISSR-PCR产物电泳图
根据电泳图1所示,依扩增条带的敏感性与特异即条带的强弱和杂带的多少,将各处理的结果做1~9分记分,条带数量丰富、清晰度高和背景低的最佳产物记为9分,与此相反,最差的记为1分，因此1到9个组合的分数依次为5分、7分、9分、6分、3分、8分、1分、4分、2分。 每个因素同一水平下的数值之和越大，该水平就越好；极差越大，该因素对反应体系的影响越显著。由表1可知，选定的3个水平范围内，ISSR-PCR反应中，对反应影响最大的是Mg2+、dNTP、之后是引物，最后是Taq酶。最佳水平为Mg2+1.25mmol/L、dNTP 0.425mmol/L、引物0.8μmol/L、Taq酶为0.5U。与此一致的组合并没有在正交表中出现，但与分值最高的3号组合很接近，仅有酶这一因素不同。ISSR反应体系的正交试验设计极差分析见表7。
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表7 ISSR反应体系的正交试验设计极差分析 Table 7 ISSR reaction range analysis of orthogonal test design
编号 K1 K2 K3 ?K1 ?K2 ?K3 R0
Mg2+ 21 12 7 7 4 2.33 4.67
引物 12 14 19 4 4.67 6.33 2.33
Taq酶 17 15 13 5.67 5 4.33 1.34
dNTP 10 16 19 3.33 5.33 6.33 3
注：K为各列各水平的和；?K为各水平的均值；R0为极差
3.2指纹图谱建立
3.2.1 SRAP指纹图谱
选取瞿麦、大苞石竹、针叶石竹、高石竹4个种的DNA进行引物筛选，筛选出具有多态性位点、条带清楚稳定的12对SRAP引物，最终确定Me3/Em12、Me3/Em14、Me8/Em14、Me8/Em9这4对引物用于指纹图谱的构建，4对引物组合可以将10个种鉴别开，其中Me8/Em9扩增效率较高，SRAP指纹图谱见表9。
表9 10个种的SRAP数字指纹图谱 Table 9 10 species of SRAP fingerprints
材料编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Me3/Em12 100110 100100 110011 001001 110010 011000 110100 011000 001100 101001
Me3/Em14 01001010 01111110 01101101 00000110 01100000 01000001 11000000 01000100 01001001 01111000
15
Me8/Em14 0101000 0111000 0111100 1111011 0001000 1110110 1010110 1100111 1110011 0101000
Me8/Em9
100001 011100 010100 000011 011100 101001 110101 101001 111001 000001
3.2.2 ISSR指纹图谱
通过4个种的引物筛选， 从50对ISSR引物中筛选到6对可扩增出条带清晰，多态位点丰富ISSR引物进。最终确定826，842，864，878，827这5对引物用于指纹图谱的构建。其中864引物和878引物的扩增效率较好，5对引物组合可以将10个种鉴别开。ISSR指纹图谱见表10。
表10 10个种的ISSR数字指纹图谱 Table 10 10 species of ISSR fingerprints
材料编号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
826 010101 000100 000100 011001 010010 110000 010000 010000 000100 010001
842 10011111 10101010 01111010 00011011 00101011 01111010 11001101 01101101 01001010 00010100
864 0010110 1000001 1010001 0111000 1000001 0000010 0010010 1010000 0000010 0011100
878 001101 110010 111001 100111 111000 100011 000111 000001 100101 101001
827 001000 001000 100011 110111 010110 100110 010111 010110 010010 001100
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4 讨论
4.1 分子标记的体系优化
本研究首先采用正交设计得到最初的最佳反应组合，与以往的单因素PCR优化设计相比，利用正交验直观分析方法，能迅速获得满意的试验结果，而且试验规模小，节省人力物力，利用正交设计已经成功完成了如观赏贝母[32]、星星草[33]等ISSR-PCR反应体系优化，以及番茄[34]、牡丹[35]、一品红[36]等的SRAP-PCR反应体系优化。但该方法亦有一定的局限性，如对试验结果本身优劣的判断带有主观上的成分[33]，一般是根据电泳条带的清晰度及数目是否合适判断试验结果的好坏，而且正交实验设计不能够对主效和互作作出精确的估计，故选出的组合不一定是最优的。因此，可以在此基础上进行单因素实验，最终得到两组实验结果，相互验证和参照。
4.2指纹图谱构建
本研究从50对ISSR引物中选出6对有效的ISSR引物，这一点与梁景霞等的研究报道一致[37、38]以及从80对SRAP引物中选出16对有效的SRAP引物可对石竹属10个种进行有效扩增，并绘制出DNA指纹图谱，说明ISSR、SRAP分子标记技术在指纹图谱构建中的高效性和有效性。此外，通过两种分子标记的有效引物比例、扩增出条带的稳定性和清晰度、指纹图谱的种间鉴别力等方面，可以证实SRAP标记优于ISSR标记。如ISSR标记864引物一次只可鉴别出4个种，而SRAP标记 Me8/Em9引物仅一对引物就可鉴别出6个种，因此SRAP标记是指纹图谱构建和种间鉴定的较理想标记，许多前人在指纹图谱的研究中也得到相似的结果 [39、40]。
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