图3-13 pUC18质粒载体图谱 二、基因文库技术 基因文库(Gene Library)是指在一种载体群体中, 随机地收集着某一生物DNA的各种克隆片段, 理想地包含着该物种的全部遗传信息(图3-18)。因此, 基因文库是人工构建的某一生物基因的“活期储蓄所”, 根据构建方法的不同,分为基因组文库、cDNA文库等。根据基因库的含量,又分为全库和特异性的库,全库含有某一生物的全部遗传信息,而特异性的库是不完整的,如差示库。早期将通过构建基因文库来筛选所需克隆的方法称为鸟枪法。
图3-18 基因文库技术（J.J.Greene & Rao V.B.,1998）
11
第三节 体外重组
一、体外重组的方法
DNA重组连接的方法大致分为四种: 粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连接法。 1. 粘性末端连接法
粘性末端连接(Cohesive end ligation)是指具有相同粘性末端的两个双链DNA分子在DNA连接酶的作用下, 连接成为一个杂合双链DNA(图3-14)。粘性末端可由识别回文序列的内切酶所产生, 或是用末端转移酶来制备。 凡是识别回文序列的内切酶切割DNA产生的末端都是粘性末端, 只有用同一种酶切割产生的相同粘性末端才能通过末端单链的碱基配对并在DNA连接酶的作用下进行连接。
图3-14 黏性末端连接法（引自 Snyder & Champness , 1977）
粘性末端连接法是最常用的DNA连接方法, 酶切片段基本不需作什么处理就可以用于连接, 既经济又省时。由于大多数限制性内切酶都可以产生粘性末端, 操作方便。另外,通过粘性末端连接的重组体, 其外源片段很容易回收, 只要用原来的酶切割重组体就可以了。
另外，也可以通过双酶切来获得黏性末端，并可进行定向重组连接（图3-15）。
图3-15 双酶切进行定向重组连接（引自 Snyder & Champness , 1977）
平末端连接(blunt end ligation)是指在T4 DNA连接酶的作用下(可加入适量的RNA连接酶), 将两个具有平末端的双链DNA分子连接成杂种DNA分子。
平末端连接的效率比粘性末端连接的效率低得多,所以通常在连接反应体系中要适量添加促进大分子凝聚的凝聚剂,以提高平末端DNA连接的效率。常用的是PEG8000, 加入后, 可以起到两个作用: 一是可将平末端连接的效率提高
12
1-3个数量级; 二是改变连接产物的分布, 抑制分子内的连接, 促进分子间的连接, 得到的连接产物主要是重组体。
平末端连接的不利之处是连接效率低, 需要大量的连接酶, 有时为了提高连接效率, 通常要补加RNA连接酶。连接后, 缘由的限制性内切酶内切酶的切点要消失, 所以不易回收插入的外源DNA片段。 3. 同聚物加尾法
所谓同聚物加尾(homopolymer tails joining)连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3'端各加上一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端, 外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC), 然后在DNA连接酶的作用下, 连接成为重组的DNA。这种方法可适用于任何来源的DNA片段, 但方法较繁, 需要λ核酸外切酶、S1核酶、末端转移酶等协同作用（图3-16）。
同聚物接尾法实际上是一种人工粘性末端连接法, 具有很多优点:①首先不易自身环化,这是因为同一种DNA的两端的尾巴是相同的, 所以不存在自身环化。②因为载体和外源片段的末端是互补的粘性末端, 所以连接效率较高。③用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接, 所以是一种通用的体外重组的方法。
图3-16 同聚物尾连接法(引自Old & Primrose,1980) 1. 基因组DNA文库
所谓基因组文库(genomic DNA Library), 就是用基因工程的方法,人工构建的含有某一生物基因组DNA的各种片段的克隆群。一般以改造的噬菌体DNA或柯斯质粒作为载体, 包括下列过程(图3-19): ①高分子量染色体DNA的制备, ② 体外重组连接, ③ 包装蛋白的制备, ④重组体的体外包装, ⑤将重组DNA导入寄主细胞, ⑥筛选。建造基因组文库不仅可以大量扩增含量极少的单拷贝的结构基因, 也可以克隆调控基因, 有利于研究基因的结构、功能和调控机理。
基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。基因库(gene pool)是指在行有性生殖的某一群体中, 能进行生殖的个体所含总的遗传信息。在基因组文库的构建中, 由于使用的载体不同, 分为噬菌体载体和柯斯质粒载体构建的基因组文库、YAC文库、BAC文库。
13
图3-19 基因组文库技术(引自Griffiths et al.1996) 2. cDNA文库
同mRNA互补的DNA称为cDNA。mRNA为模板合成的cDNA可以用于基因的克隆化, 也可用这种方法制备特异性的杂交探针。cDNA文库是以某一生物的总mRNA为模板, 在无细胞系统中, 在反向转录酶的作用下, 首先合成一互补的DNA, 即第一链, 破坏RMA模板后, 再以第一链为模板合成第二链, 得到的双链DNA称为cDNA基因。选用适合的载体, 将合成的cDNA基因重组导入寄主细胞, 经筛选得到的cDNA基因的克隆群称为cDNA文库( completement DNA Library) (图3-20)。由于cDNA技术合成的是不含内含子的功能基因, 因此是克隆真核生物基因的一种通用方法。
14
图3-20 cDNA文库构建(引自Old & Primrose,1980)
由于细胞内的基因在表达的时间上并非是统一的,具有发育的阶段性和时间性,有些则需要特殊的环境条件。所以,cDNA文库是不可能构建得十分全,也就是说任何一个cDNA文库都不可能包含某一生物全部编码基因。所以在构建cDNA文库时应根据研究目的的不同而选用不同的生物材料作为RNA分离的出发材料,有些甚至要经过特殊的诱导处理以提高所需DNA的丰度。
第五节 重组DNA的转移、筛选与鉴定
转化是基因工程操作中一项十分重要的工作。DNA重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化(transformation)。
重组体的筛选有两层涵义,一是将携带有外源插入DNA片段的克隆挑选出来,二是将将携带有特定外源插入片段的重组体挑选出来。鉴定则是对筛选的重组体进行最后的鉴别。 一、重组DNA的转化
能够接受转化作用的细菌的生理状态叫感受态。细菌的感受态是在适当的生长条件下获得的一种生理特征。要强调的是: 感受态是有关转化因子被吸收的生理状态, 而不是有关转化因子进入细胞后能否被接受的生理状态。处于感受态的受体细菌，其吸收转化因子的能力为一般细菌生理状态的千倍以上，而且不同细菌间的感受态差异往往受自身的遗传特性、菌龄、生理培养条件等诸多因素的影响。 在自然条件下, 大多数类型的细菌不出现感受态，也不发生转化。然而可以通过某些化学诱导的方法来制备感受态，用这种方法得到的感受态就称为人工诱导的感受态细胞。目前常用的诱导感受态转化的方法是CaCl2 法（图3-21），此外也可以用基因枪等方法转化外源DNA。
15