图3—27克隆羊“多莉”诞生的过程 (引自Glick & Pasternak，1998)
1998年，日本科学家利用成年动物体细胞克隆的两头牛犊诞生；同年，美国科学家用成年鼠的体细胞成功地培育出了第三代共50多只克隆鼠；1999年，夏威夷大学的科学家利用成年鼠体细胞克隆出第一只雄性老鼠；2000年1月，美国科学家宣布克隆猴成功，这只恒河猴被命名为 “泰特拉”；同年3月，曾参与克隆小羊“多莉”的英国PPL公司宣布，他们成功培育出5头克隆猪。2002年，我国科学家成功克隆出牛和山羊，使我国成为少数掌握体细胞克隆哺乳动物关键技术的国家之一。2003年，美国、意大利等国科学家分别培育出世界上第一匹克隆骡子和克隆马。中国和法国科学家合作首次克隆出大鼠。 (二) 蛋白质工程
蛋白质工程是根据分子设计的方案，通过对天然蛋白质的基因进行改造，来实现对其所编码的蛋白质的改造，它的产品已不再是天然的蛋白质，而是经过改造的，具有了人类所需要特性的特殊蛋白质。天然蛋白质都是通过漫长的进化过程自然选择而来的，而蛋白质工程对天然蛋白质的改造，能更快、更有效地为人类服务。
重组人p干扰素(IFN p)的人工改造是蛋白质工程的一个成功范例。干扰素(interferon)是人体细胞分泌的一种蛋白质，具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能，是人体防御系统的重要组成部分。重组人IFNβ是采用重组DNA技术，克隆人β干扰素基因，构建合成干扰素的基因工程菌，经发酵、提纯、纯化制备而成。其基因工程产物活性为10万U/mg，仅是天然IFN口产物活性的10%。蛋白质结构分析发现，人IFNβ由154个氨基酸组成，在17、41、141位有3个半胱氨酸(Cys)，人体天然产物在41、141间形成二硫键，基因工程产物二硫键位置有偏差，17位 Cys 的巯基参与二硫键，形成无活性的二聚体或寡聚体。由于丝氨酸(Ser)与半胱氨酸在结构上除羟基(-OH)与巯基(-SH)外完全一样，因此将17位Cys点突变为Ser，结果证明人工改造的IFN口产物活性提高100倍，稳定性好于天然产物。 (三) 酶工程 酶工程(enzyme engineering)就是通过对酶的修饰改造，提高酶的催化效率并在某一生物反应器中大规模生产的技术过程，主要包括酶的发酵生产、酶的分离纯化、酶分子修饰、酶和细胞固 定化、酶反应动力学与反应器、酶的应用等。
酶工程的应用主要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中(表3—4)。例如，固定化青霉素 酰化酶用于连续裂解青霉素生产；α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖异构酶连续作用于淀粉，就 可以生产出各类糖浆；利用葡萄糖苷酶可生产出低糖啤酒；蛋白酶用于除去毛皮中的特定蛋白， 软化皮革等。加酶洗衣粉、用蛋白酶生产的嫩肉粉等，都是酶工程的产物。此外，酶工程还用于 农副产品的加工利用。美国利用大豆生产出200余种产品，包括营养食品、药品、食品添加剂等， 例如高纯度大豆卵磷脂、大豆蛋白等。目前工业生产的酶有60余种，其中规模化生产仅20 余种。
表3—4酶工程的主要应用领域 应用领域 酶 类
主要用途
21
淀粉酶类 蛋白酶类 糖化酶 葡萄糖苷酶 凝乳酶 果胶酶 淀粉酶类
纺织工业 纤维素酶
蛋白酶类 蛋白酶类
葡萄糖、麦芽糖生产，啤酒酿造，面包、饼干等, 烘烤食品制作等 嫩肉粉、饼干、蛋白胨、乳酪生产，啤酒澄清，肉类加工(如香肠熟化等) 淀粉液化，糊精降解 低糖啤酒生产 乳酪生产 果酒、果汁去浊 纺织品褪浆
处理纤维制品，提高棉毛纺织品质量 丝制品脱胶处理
加酶洗涤剂、加酶护肤品与化妆品生产
食品工业 葡萄糖异构酶 高果糖浆生产
淀粉酶类 加酶洗涤剂生产 日化工业
超氧化物歧化酶 化妆品生产
糖酐酶
制革工业 蛋白酶类
羟化酶 酪氨酸酶 蛋白酶类
医药工业 天冬酰胺酶
溶菌酶 尿激酶 链激酶 其他多种酶 淀粉酶类 溶菌酶
牙膏添加剂 皮革去毛、软化 氢化可的松生产 多巴(主治帕金森病)生产
氨基酸、蛋白水解液生产，治疗消化不良，消肿，降压等 治疗白血病 消炎，镇痛，止血等 治疗心肌梗死、结膜出血等 治疗血栓性静脉炎、血肿等
多种疾病诊断(如葡萄糖氧化酶诊断糖尿病，胆碱酯酶诊断肝 炎等) 处理造纸工业废水 处理高有机物含量废水
环境监测试剂(如胆碱酯酶监测有机磷农药，硫氰酸酶监测氰
化物等)
青霉素酰化酶 青霉素、头孢霉素生产
葡萄糖脑苷酯酶 治疗高雪病(葡萄糖脑苷酯酶缺乏症)
超氧化物歧化酶 治疗红斑狼疮、皮肌炎、辐射损伤等
环保工业 丁酸梭菌酶系 处理酿酒工业废水
其他多种酶
(四) 发酵工程
发酵工程(fermentation engineering)是利用微生物的特性，通过现代化工程技术，在反应器中生产目的产物或提供所需服务的技术过程。“发酵”一词来源于拉丁语动词 fervere(发泡)，意指利用酵母以果汁或麦芽汁为原料生产酒精饮料时出现的现象。传统的发酵技术有悠久的历史，早在几千年前人类就利用有益的微生物生产食品和药物，如酒、醋、酱、奶酪等。现代发酵工程是在传统发酵工艺基础上结合基因工程、细胞工程、酶工程等现代高新技术发展而成，由于其主要以微生物培养为主，因而也称微生物工程。
发酵工程由3部分组成(图3—28)：上游工程、发酵过程和下游工程。其中上游工程包括优良菌株的选育、最适发酵条件(pH、温度、溶氧和营养组成)的确定、营养物的准备等。发酵过程主要指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术。这里要有严格的无菌生长环境，包括发酵开始前采用高温高压对发酵原料和发酵罐以及各种连接管道进行灭菌的技术，在发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空气的空气过滤技术，在发酵过程中根据 细胞生长要求控制加料速度的计算机控制技术，还有种子培养和生产培养的不同的工艺技术。
22
图3—28发酵工程的基本流程
微生物发酵产品可分为以下几大类：
1. 微生物细胞(生物量)作为产品，如单细胞(酵母)蛋白作为食品或饲料。
2. 微生物代谢物产品，目前医用抗生素、农用抗生素等已有近200个品种，绝大部分都是发酵产品。此外，
发酵产品还包括酒精、氨基酸、柠檬酸和工业用酶等。味精、多种维生素等也是发酵工程的产品。 3. 基因工程产品。微生物(如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌和酵母等)是最常用的重组基因的表达系统。主要
产品包括干扰素、胰岛素、牛凝乳酶、G—CSF(粒细胞集落刺激因子)、EPO(红细胞生成素)和 tPA ( 重组组织型纤溶酶原激活剂)等。
(五) 生物医学工程
生物医学工程(biomedical engineering)是综合生物学、医学和工程学的理论和方法而发居 起来的新兴综合学科。生物医学工程开始以仿生学原理制造人工器官，如心脏起搏器、人造心脏、假肢等，以及用于诊疗手段的医学仪器。后来人体器官移植成为医疗中可以选择的手段，但常常要克服异体器官的排斥反应，在用药物能够解决排斥反应之前，人体器官移植成功的例子很少。由于生物技术迅猛发展，在DNA双螺旋结构发现50年后，人类基因组计划已经完成，对人 类基因全面了解后，人们已经将眼光投到干细胞克隆和治疗性克隆(非生殖性克隆)，一些国家如美国建立了胚胎的干细胞系，用于包括治疗性克隆等方面的研究。国外已经成功地从自体鼻窿腔内取出干细胞，导人心脏，去除心脏因炎症等留下的疤痕，恢复了心脏的正常功能，以及用血液中的干细胞修复因车祸等造成四肢瘫痪患者的脊髓神经，使他们重新站立起来。这是因为即便是成人，一些在胚胎时期存在的干细胞仍可以留存在身体的各部分，或者作为专能干细胞，也在人体的器官中，这些干细胞能够在特定的情况下进一步分化为组织。利用自体的干细胞也免除 了异体器官移植糟糕的排斥反应。这种利用人体自身干细胞修复人体受损部分已经成功的例子 以及治疗性克隆的前景，为解除人类的病痛带来了福音。 (六) 生物信息工程
生物信息工程(biological information engineering)可以简单地定义为计算机与信息技术在生命科学中的应用，它是一个年轻和快速发展的领域。生物信息工程运用数学、计算机科学和生 物学来阐明和理解大量生物学研究的实验数据中所包含的生物学意义，包括此类数据的采集、贮存、整理、归档、分析与可视化等。
以人类基因组计划(human genome project，HGP ) 为序幕的生物信息学研究，是全面认识生命及其过程的重要手段，由此引发的生物信息革命，将从根本上改变生命科学和生物产业的思维方式和研究体系。人类基因图谱绘制既是生物学的突破也是计算科学的壮举。在生物学家看来，存在于基因组中的碱基对序列是宝贵的生物信息资源，是未来生物工程产业的支柱。人类 3万～4万个基因的信息以及相应的染色体位置被阐明后，将成为医学和生物医药产业知识和技 术创新的源泉。一些困扰人类健康的主要疾病，例如心脑血管疾病、糖尿病、肝病、癌症、老年痴 呆症等都与基因有关，可以依据已知的基因序列和功能，找出这些基因并针对相应的靶位进行药 物筛选，并设计新药。到2002年底，已有1 500多种致病基因被标记。信息技术有史以来首次 成为推动实验生物学和医学发展的主要动力。这一趋势明显地表现在所有与了解疾病起因、新药开发相关的关键领域中——基因组学、蛋白质组学以及代谢途径的研究等，这些专业的研究需要依靠强大的计算机系统、数据和存储管理系统来完成大量的数据处理工作。而这些对生命的 研究数据将帮助人类解开人体内数以万计蛋白质种类的基因编码秘密。此外，利用生物信息工 程技术建立动、植物良种及相关有用基因数据库将有助于各种家畜、作物的基因改良。
23
四、转基因动物
图3—30转基因鼠 (引自Griffiths et al，1999)
传统的家畜改良主要是通过多代选择性交配改良饲养动物的遗传性状，如产奶、羊毛品质、 生长速度和产蛋率等。在每一轮连续世代中，那些具有优越性状的动物可作为选育良种。这种 交配、选育的方式虽然费时、费力，但却很成功，现今几乎所有的家畜都经过这种改良。但是这种 方法不能将单一的功能基因或基因簇引入高等动物的染色体DNA上。
经过20世纪80年代不懈的努力，借助于受精卵原核显微注射和早期胚胎细胞的反转录病 毒感染等手段，将基因导入受精卵产生新
品种的设想已成为现实。动物转基因技术迅速成为研 究哺乳动物基因表达和发育的有效手段，在建立研究人类疾病的动物模式系统中发挥着作用，还 可以使动物的乳腺分泌含有药用蛋白的乳汁，因而出现了“乳腺生物反应器”。
转基因技术在小鼠的研究中发展得较为成熟(图3—30)。20世纪80年代以来，已经将几百种基因导入不同的品系中。这些研究使人们对基因调控、肿瘤发生、免疫专一性、发育的分子遗 传学及其他一些基本的生物活动过程有了更多的了解。转基因小鼠还可作为人类治疗药物的检测动物，不同的转基因品系可作为研究人类遗传疾病的生物医学模型。
(一) 基因导入动物的方法
在转基因中，DNA可通过3种方式导入：①反转录病毒介导感染早期胚胎细胞，然后植入 雌性动物体内。②显微注射到受精卵内膨大的精核(雄性原核)中。③基因工程处理胚胎干细胞，导入一个早期发育胚胎后再植入雌性动物体内。
1．反转录病毒载体法
图3—31显微注射法进行动物转基因的基本过程 (引自Glick & Pasternak，1998) 在各种基因转移方法中，反转录病毒作为载体能够有效地使转移基因整合到受体细胞基因组中。但是，这类载体只能携带小片段(约8 kb)DNA，因为长度的限制，这些转移基因可能缺少关键的相邻调控序列。
使用病毒载体有一个最主要的缺陷， 虽然这些载体被设计为复制缺陷型，但是用于制备大量载体DNA的病毒株的基因 组可同样进入细胞核。除非采取特殊的预防措施，这些辅助病毒会在转基因个体中复制、产生。无论是直接将转基因个体作 为食品，还是利用其产物，都应绝对避免病毒的污染，所以，反转录病毒介导法很少用于生产经济用途的转基因动物。 2．DNA显微注射法
由于反转录病毒介导法的不足，显微注射DNA成为产生转基因小鼠的首选方法。 整个过程包括3个主要步骤(图3—31)： ①刺激供体雌性鼠超量排卵，以产生足够的受精卵用于注射。首先注射孕马血 清，约48 h后再注射人绒毛膜促性腺激素，一只超量排卵的小鼠可产生大约35颗 卵，而不是通常的5～10颗卵。 ②雌鼠经过交配，受精卵从输卵管中洗出。
③立即对采集的受精卵进行显微注 射。注射的转移基因通常是线性结构，不采用原核生物的载体序列。
整个过程看似简单，但需要一系列实 验步骤的配合，并且成功率最高也只有 5%左右，所以必须对大量的卵进行注射。 例如，
24
经注射的卵有66%的成活率，成活的受精卵25%可正常发育，25%的后代携带转移基因，那么，注射1 000个受精卵，才能获得 30～50个转基因后代。并且，DNA在染色体上随机整合，在某些个体中，转移基因由于整合位点 不当而不能表达，在某些个体中因拷贝数高而过度表达，这会干扰动物的正常生理活动。 3．胚胎干细胞法
小鼠胚胎发育卵泡阶段的细胞在培养基中依然保持分化能力。当把它们重新输回胚胎胚泡后，仍保留着分化成其他细胞(包括生殖细胞)的能力，这类细胞称多能性胚胎干细胞(ES cell)。 ES细胞在体外培养时可承受转基因操作而不影响其分化的多能性。外源基因通过同源重组可 特异性整合在ES基因组内的一个非必需位点上，构成工程化胚胎干细胞。经体外筛选鉴定、扩大培养后再输回小鼠胚胎胚泡中，最终形成转基因动物(图3—32)。这种方法避免了前两种方法带来的整合随机性。
图3—32胚胎干细胞基因转化法 (引自G1ick & Pasternak，1998) (二) 转基因动物的应用
转基因动物具有广阔的应用前景，目前主要应用于以下几个方面：①利用动物转基因技术 研究基因的表达与功能。②利用转基因动物或细胞生产生物大分子。③ 利用转基因技术进行 动物遗传性状改良的研究。④基因治疗。 1．乳腺生物反应器
由于基因工程技术的出现，人类已可以大量取得过去只能从组织中提取的珍稀蛋白，用于研究或治疗疾病。可以完成这件工作的系统有细菌发酵、真核细胞培养和乳腺生物反应器等3种主要生产方式。在这3种生产方式中，乳腺生物反应器有特殊优点。乳腺生物反应器是根据细胞生物学中蛋白质合成与分选的机制，结合基因工程技术、动物转基因技术等，利用动物的乳腺分泌某些具有重要价值的基因产物(图3—33)。
25