图3-21 钙诱导的转化
二、重组体的遗传学筛选法
所谓遗传学方法(genetic selection)主要是根据受体细胞接受了重组DNA分子后所发生的遗传表型的变化直接选择重组体的方法。遗传表型的变化包括抗药性、缺陷基因的功能互补表型及噬菌斑的变化等。这些表型的变化, 有些是载体提供的表型特征, 有些则是插入序列提供的表型特征。选择的方法主要是根据平板上可见的表型变化, 用于选择的平板包括普通抗生素平板、插入失活抗生素平板、插入表达抗生素平板、显色平板等, 由于这些方法都是直接从平板上筛选,所以又称为平板筛选法。
（一） 插入失活筛选法
从原理上讲，当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内的位点后, 使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活(insertional inactivation) 。
图3-22 插入失活的原理
图3-23 聚合酶链反应
（引自 Watson et al, 1992） 1.抗性基因插入失活筛选法
根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法是重组体常用的筛选方法。如非重组的pBR322质粒DNA上的四环素和氨苄青霉素抗性基因都是正常的, 表型为AprTcr。带有这种质粒的受体菌可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性平板上生长。但是, 如果在该质粒的四环素抗性基因内插入外援片段, 就会造成四环素抗性基因失活, 变成AprTcs, 携带这种质粒的宿主菌可以在氨苄青霉素的平板上生长, 而不能在四环素抗性平板上生长(图3-22)。
2. 蓝白斑筛选法
根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法需要进行菌落平板的影印复制, 才能够将所需的重组体挑选出来, 大大增
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加了筛选的工作量。后来, 人们设计了以β-半乳糖苷酶的产生作为颜色筛选标记的载体, 简化了筛选程序, 提高了灵敏度。 这类载体系统包括M13噬菌体、pUC质粒系统、pEGM质粒系统。它们的共同特点是载体上携带一段细菌的lacZ基因, 它编码β-半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的α-肽, 载体转化的受体菌为lacZΔM15基因型。这样, 载体同宿主通过互补, 具有完整的β-半乳糖苷酶的活性。如果在载体的lacZ基因中插入外源DNA, 造成lacZ基因失活, 不能合成α-肽, 失去同宿主的互补, 不能形成有功能的β-半乳糖苷酶, 失去分解X-gal的能力。在X-gal平板上, 含阳性重组体的细菌为物色菌落(质粒载体)或无色噬菌斑(M13噬菌体载体); 非重组体转化的细菌为蓝色菌落或蓝色噬菌斑。
显色反应筛选方法比较简单, 但是β-半乳糖苷酶的合成需要诱导。实验中起诱导作用的是安慰诱导物--IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷), 作用底物是X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)。通常是将X-gal和IPTG混合后, 涂布在固体平板的表面。 (二) PCR法
聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种体外扩增特定DNA序列 的新技术，这种DNA的体外扩增是通过同 DNA双链互补的两个引物在DNA聚合酶 的作用下，进行引物延伸来完成的。在反应系统中，需要有：①模板(含有特定序列的 DNA分子)。②两个寡聚核苷酸引物，这 两个引物可同双链DNA分子的互补链杂交，并且位于靶DNA欲扩增区的两侧。 ③耐热DNA聚合酶。④4种脱氧核糖单核苷酸。然后经过不同温度的循环进行DNA扩增(图3—23)。这一技术是Kary Mullis在1985年发明的，并于1993年获得诺贝尔化学奖。 PCR应用十分广泛，并且可通过菌液PcR进行重组克隆的快速筛选。基本方法是从抗性平板上挑取单菌落接种至250 μL的LB培养基中，200r/min 振荡培养8h 以后，取1μL菌液进行裂解制备模板进行PCR筛选。
（三）核酸杂交筛选法
核酸杂交又叫分子杂交(molecular hybridization), 是鉴定和筛选重组体的一种方法。原理是: 两条具有碱基互补序列的DNA分子变性后, 在溶液中一起进行复性时, 可以形成杂种双链DNA分子。同样, 一条DNA链与之具有互补碱基序列的RNA链在一起复性时, 也能形成双链结构(DNA-RNA杂交体)。杂交包括下列过程: ①DNA的“熔解”, 即变性, 目的是使双螺旋解开成为单链, 这可将DNA溶液的温度升高超过Tm值(解链温度)即可; ②退火, 即DNA的复性, 将加热过的DNA溶液缓慢冷却即可发生。 杂交的双方是待测的核苷酸序列及探针。待测核酸序列可以是克隆的基因片段, 也可以是未经克隆的基因组DNA或是细胞总RNA。 核酸杂交方法的两个特点是高度特异性及高度灵敏性。 1. 菌落杂交
在大量筛选重组的细菌细胞时, 需要从中寻找出为数极少的含有目的序列的细胞。另外. 在利用插入失活、显色反应等手段得到含重组质粒的细菌细胞后, 还需要证明这些重组质粒是否含所需要的目的序列。若将所得菌落逐个扩大培养, 提取质粒DNA, 然后用Southern杂交法固然可以鉴定重组质粒, 不仅工作量大, 又耗费财力, 用菌落杂交(colony hybridization) (图3-24), 就方便得多。
首先要将转化的受体菌在合适的琼脂平板上制成单菌落,然后将菌落复制到硝酸纤维素滤膜上, 保留主平板,将硝酸纤维素滤膜上的菌落进行原位溶菌、原位释放DNA、原位进行DNA变性、中和洗涤后进行原位固定。然后同特异的探针进行杂交,通过放射自显影后,有杂交信号的即为重组体,对照主平板则可将重组体选择出来。
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图3-24 菌落杂交的基本过程(引自Old & Primrose,1980) 2. Southern 杂交
Southern 杂交(Southern hybridization)是1975年Southern建立起来的一种杂交方法, 属固相-液相杂交。该法的主要特点是利用可毛细现象将DNA转移到固体支持物上,称为Southern转移或Southern 印迹(Southern
blotting)。它首先用合适的限制性内切酶将DNA切割后, 进行电泳分离后, 利用干燥的吸水纸产生毛细作用, 使液体经过凝胶, 从而使DNA片段由液流携带而从凝胶转移并结合在固体支持物表面，然后进行杂交( 图3-25)。
图3-25 Southern 杂交中的DNA转移(引自Alberts et al.2002) 3. Northern 杂交
Northern 杂交(Northern Hybridization)是分析RNA的一种方法,它的基本原理是将RNA样品通过变性琼脂糖凝胶电泳进行分离,再转移到尼龙膜等固相膜载体上,用放射性同位素标记的DNA或RNA特异探针对固定于膜上的mRNA进行杂交,洗膜去除非特异性杂交信号,经放射自显影,对杂交信号进行分析。将杂交的mRNA分子在电泳中的迁移位
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置与标准分子量分子进行比较,即可知道细胞中特定的基因转录产物的大小,对杂交信号的强弱比较, 可以知道该基因表达mRNA的强弱。这一技术应用十分广泛,常用于基因表达调控、基因结构与功能、遗传变异及病理研究。主要用来检测外源基因在受体细胞中是否转录成RNA。
Northern 印迹的原理同Southern 印迹。但有两点不同: 其一是转移的对象不同, Northern 印迹是将RNA变性及电泳分离后, 将其转移到固相支持物上的过程。其二, 虽然RNA电泳前不需向DNA那样进行酶切, 但也需要变性。不过变性方法是不同的, 它不能用碱变性, 因为碱变性会导致RNA的水解。
Northern杂交与Southern杂交的主要区别是在变性剂存在下, 用琼脂糖进行电泳分离RNA。变性剂的作用是防止RNA的二级结构发夹环的形成, 保持其单链线性状态。
第六节 生物技术及应用
基因工程技术的发展推动了生物技术(biotec}lnokogy)的发展，现代生物技术作为一门综合性的学科，与现代微生物学、生物化学、细胞生物学、遗传学、分子生物学和化学工程等多学科密切相关。生物技术产业从20世纪80年代开始起步，经过20年的发展，目前在农牧业、食品、医药等领域得到广泛的应用。生物技术产业市场逐渐形成，其前景广阔，将成为21世纪经济的支柱产业。
(一) 细胞工程
细胞工程(cell engineering)是利用细胞的全能性，在细胞或细胞器水平上改变细胞的某些遗传特性，以改良其性状、获得有用基因产物或加速细胞及生物体繁殖的综合技术，可分为微生物细胞工程、植物细胞工程和动物细胞工程，是以细胞培养技术为基础，通过细胞融合、细胞核移植、动物克隆、染色体工程和生物反应器来实现。 1．细胞融合
细胞融合(cell fusion)又称体细胞杂交(somatic hybridization)，是指两个不同来源的细胞， 彼此融合成杂交细胞，使来自两个亲本细胞的基因有可能都被表达，打破远缘生物不能杂交的屏障，形成新物种或新品种的技术。1975年，英国剑桥大学的科学家科莱尔(G．Kohler)和米尔斯坦(C．Milstein)用细胞融合技术将能分泌抗体的B淋巴细胞(绵羊红细胞、免疫小鼠脾细胞)与具有无限生长能力的肿瘤细胞(小鼠骨髓瘤细胞)融合，得到了既能持续产生单一抗体又能在体 外无限繁殖的杂合细胞(杂交瘤细胞，hybridoma cell)(图3—26)，通过细胞培养将杂合细胞克隆为单纯的细胞系(单克隆系)，由此类细胞系可获得结构和特性完全相同的高纯度抗体，即单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb)。这一技术的创立在生物医学领域取得重大突破，两位科学家因而荣获1984年诺贝尔生理医学奖。
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图3—26 利用细胞融合技术制备单克隆抗体 (引自Kuby，1994)
如今这种细胞融合技术已在动物间实现了小鼠和田鼠，小鼠和小鸡，甚至于小鼠和人等许多远缘和超远缘的体细胞杂交。虽然目前动物的杂交细胞还只停留在分裂传代的水平，不能分化 发育成完整的个体，但在理论研究和基因定位上都有重大意义。而植物间的细胞融合所得到的杂交细胞，获得了新的杂交植物，如西红柿与马铃薯细胞融合获得“西红柿马铃薯”，羽衣甘蓝与白菜型油菜细胞融合得到“甘蓝型油菜”等。 2．细胞核移植
细胞核移植是将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵细胞内的显微操作技术。由于主要遗传物质存在于细胞核内，因而此技术可获得遗传上具同质性状的动物，对动物优良杂交种的无性繁殖和濒临绝迹的珍贵动物的传种具有重大意义。1952年，美国科学家布里格斯(R．Briggs)首次利用豹纹蛙卵细胞建立了细胞核移植技术。1981年，瑞士科学家 K．111menses率先对哺乳动物小鼠卵细胞进行核移植获得成功。他将灰鼠的细胞核注入到除去了精核和卵核的黑鼠的受精卵内，然后再将这一f'Fh黑鼠细胞质和灰鼠细胞核组成的卵细胞体外培养，得到的仔鼠是灰色的，说明仔鼠的性状取决于细胞核的来源。
在细胞核移植技术上发展起来的动物体细胞克隆技术在1997年因克隆羊“多莉”(Dolly)的 诞生而取得了重大突破。英国科学家维尔穆特(I．wilmut)等1997年2月27日在《自然》描述了 “多莉”的克隆过程(图3—27)。他们取出六龄的芬兰多塞特白绵羊母羊的乳腺细胞核，将此核导入苏格兰黑绵羊去核的卵细胞内，待手术完成之后，以相同频率的电脉冲刺激换核卵，让苏格兰 黑绵羊的卵细胞质与芬兰多塞特白绵羊母羊乳腺细胞的核相互协调，使这个“组装”细胞在体外发育成早期胚胎，然后将胚胎植入另一只母羊的子宫内，产下了小绵羊“多莉”。“多莉”不是由母羊的卵细胞和公羊的精细胞受精的产物，而是体细胞核加去核的卵细胞质，不经两性结合诱导出来的胚胎产生的。“克隆羊”的诞生表明：动物体中执行特殊功能、具有特定形态的所谓高度分化的细胞与受精卵一样具有发育成完整个体的潜在能力。
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