基酸只在分子表面。[Drawn from 1MBD.pdb]
极性氨基酸和非极性氨基酸分布的反差反映了构建蛋白质空间结构的重要原则。在水溶液环境中，疏水性氨基酸受水分子排斥的倾向强烈，驱使蛋白质进行折叠。当疏水侧链聚集（而不是伸展到水环境中），蛋白质热力学稳定。因此蛋白质分子折叠使疏水侧链包埋到蛋白质内部、极性带电氨基酸暴露于分子表面。很多??螺旋和??片层是两性的，即有疏水面和亲水面。疏水面朝向分子内部，亲水面指向溶液。多肽主链的命运受疏水侧链的影响。没有形成氢键的主链NH和CO基团更倾向于水环境，而不倾向于疏水环境。将疏水侧链包埋于分子内部的秘密就在于主链所有的NH和CO都能配对形成氢键。因此??螺旋和??片层的主链均有主链NH和CO配对形成氢键。紧密压紧的疏水侧链形成范德华力，这种结合力对稳定蛋白质结构有贡献。现在我们就能够理解为什么20种氨基酸侧链有不同的大小和形状。氨基酸大小和形状的差异可以提供各种选择，只有那些大小和形状完全匹配的氨基酸残基才被蛋白质选中。此时侧链基团能密切靠近，范德华力最大。
有些蛋白质能够跨越细胞膜。这些跨膜蛋白质就不遵循上述原则。疏水氨基酸在分子表面而亲水氨基酸残基处于分子内部，如细菌的外膜蛋白porin（图2.50）。膜主要是用长脂肪链构建的（12.2节）。因此外膜蛋白porin表面主要是疏水氨基酸残基，它们与相邻的脂肪链相互作用。而蛋白质中心有很多极性氨基酸残基和带电氨基酸残基。因为膜蛋白分子中心充满水分子。由于外膜蛋白在疏水环境执行其功能，因此与那些在水溶液环境执行功能的蛋白质相比结构发生了内外翻转。
图2.50 外膜蛋白porin将氨基酸位臵“内外翻转”。与生物膜疏水脂肪链接触的外膜蛋白外部氨基酸残基主要是疏水氨基酸，而与中心充满水分子接触的蛋白质内部则有很多极性氨基酸和带电氨基酸残基。[Drawn from 1PRN.pdb]
很多蛋白质具有相同的二级结构组合，这些二级结构组合常常有相似的生物功能。我们称这种二级结构组合为模体(motif)，或超二级结构。如用拐弯连接两个??螺旋构成的模体，即螺旋-拐弯-螺旋，存在于很多DNA结合蛋白质（图2.51）。
有些多肽链能折叠成两个或多个紧密区域，而这些紧密区域之间用一个柔软的肽段连接，看上去像一根绳子串起的珠子。每个紧密地区域叫结构域（domain）。结构域的大小范围不同，从30氨基酸残基到400氨基酸残基不等。例如一些免疫细胞表面蛋白CD4的胞外部分（能与HIV结合）有4个长度约为100氨基酸残基的相似的结构域(domain)（图2.52）。有些蛋白质即使三维结构互不相同，但可能有相同的结构域。
图2.51 螺旋-拐弯-螺旋模体是一种超二级结构元件。螺旋-拐弯-螺旋模体常见于DNA结合蛋白。[Drawn from 1LMB.pdb]
图2.52 蛋白质的结构域。细胞表面蛋白CD4有四个相似的域。
2.5 蛋白质四级结构：蛋白质多肽链组装的多亚基结构
在介绍蛋白质结构时常常提到蛋白质结构的四个水平。至今我们已经介绍了三个水平。二级结构是序列上相互靠近的氨基酸残基的空间排列。有些二级结构有规则性，产生周期性结构特征。??螺旋和??片层就是二级结构元件。三级结构是那些序列上差距很大的氨基酸残基的空间排列及二硫键。我们现在讨论含有一个以上多肽链的蛋白质结构。这种蛋白质结构有四个结构水平。这样的蛋白质分子中每个多肽链是一个亚基。四级结构就是蛋白质亚基的空间排列，即亚基之间的相互作用。有最简单四级结构的蛋白质是含有两个相同亚基的二聚体。?-噬菌体的cro蛋白是DNA结合蛋白，有两个相同的二聚体（图2.53）。常见的蛋白质有更复杂的四级结构，有的蛋白亚基不止一种类型，有的蛋白亚基数量有差异。例如人血液的运氧蛋白（即血红蛋白）有四个亚基。其中两个亚基属于??型，另两个亚基属于??型（图2.54）。因此血红蛋白是????四聚体。血红蛋白分子亚基排列的细微变化使该蛋白质能有效地将肺部氧气运输到身体各组织的功能(第7章）。
图2.53 四级结构。?-噬菌体Cro蛋白质是完全相同亚基构成的二聚体。[Drawn from 5CRO. pdb]
图2.54 人血红蛋白????四聚体。????四聚体中两个?亚基（红色）是完全相同的，两个?亚基（黄色）也完全相同。?亚基的结构与?亚基的结构相似但有差异。一个血红蛋白分子有四个血红素（灰色），每个血红素辅基有一个铁原子（紫色）。（A）绸带结构显示四个亚基结构类似，主要是??螺旋结构。（B）空间填充模型显示血红素辅基占据蛋白质的裂缝。[Drawn from 1A3N. pdb]
病毒是遗传信息有限的生物。它们重复使用同一亚基，对称性排列构建病毒外壳。引起普通感冒的鼻病毒（rhinovirus) 外壳蛋白有4个亚基，每个亚基有60拷贝（图2.55）。这些亚基聚集在一起形成病毒的球形外壳，将病毒基因组包裹在外壳内。
图2.55 复杂的四级结构。人鼻病毒（导致普通流感的病毒）的外壳有四种亚基（用不同颜色表示），每种亚基有60拷贝。
2.6 蛋白质的氨基酸序列决定其三维结构
蛋白质如何获得其精细的三维结构？1950年代Christian Anfinsen对核糖核酸酶进行的经典研究揭示了蛋白质氨基酸序列与蛋白质构型（即空间结构）之间的关系。核糖核酸酶是124个氨基酸残基构成的单一肽链，有四个二硫键（图2.56）。Anfinsen破坏该酶的三维结构，然后确定恢
复酶蛋白结构所需要的条件。
图2.56 牛核糖核酸酶的氨基酸序列。四个二硫键用颜色标出。[after C H W Hirs, S Moore, and W H Stein, J Bil Chem 235(1960):633-647]
尿素和盐酸胍能有效地破坏蛋白质的非共价键，但至今还不清楚这些变性剂破坏这些非共价键的作用机制。用还原试剂如??巯基乙醇(图2.57）能够可逆地破坏二硫键。当??巯基乙醇大大过量，胱氨酸的二硫键完全转化成半胱氨酸。
图2.57 ??巯基乙醇能还原二硫键。注意随着二硫键的还原，??巯基乙醇被氧化。
在8M尿素或6M盐酸胍溶液中，没有交联键（如二硫键）的大多数多肽链变成螺旋已经松散的结构。在??巯基乙醇存在下用8M尿素处理核糖核酸酶，??巯基乙醇消除了核糖核酸酶的二硫键、螺旋松散、没有酶活性。当一个蛋白质处于螺旋松散没有正常生物活性状态时，我们称这个蛋白质已经变性（denatured)（图2.58）。
图2.58 核糖核酸酶还原和变性。
Affinsen考察变性核糖核酸酶的复性。采用透析的方法除去??巯基乙醇和尿素，核糖核酸
酶的活性又慢慢恢复。他马上意识到这一发现的意义：变性蛋白的巯基被空气氧化成二硫键，酶又自动折叠成有催化活性的状态。后来详细研究揭示，如果巯基的氧化条件合适，变性蛋白复性几乎能恢复所有的酶活性。重新折叠蛋白质的理化性质与天然蛋白质没有差异。这些实验证明，有酶促活性的核糖核酸酶结构实际上已经包含于该蛋白质的氨基酸序列。后续研究证明了蛋白质都遵循这一生物化学中心原则，即氨基酸序列决定蛋白质构象。由于蛋白质构象与蛋白质功能密切相关，因此氨基酸序列决定蛋白质构象就具有特别的意义。
如果还原核糖核酸酶在8M尿素存在时进行氧化，然后透析除去尿素，只能恢复1%的酶活性。如果先除去尿素，再进行氧化则能恢复100%的酶活性。为什么有这么大的差异？原因在于尿素的存在使多肽链形成二硫键交联的位臵发生错误。在尿素存在时，形成二硫键的可能组合有105种，但是只有一种与天然蛋白质完全相同。其余104种二硫键交联方式都是错误的，没有酶促活性。不过，Affinsen加入微量??巯基乙醇到上述活性很低的蛋白质复性溶液中也能将那些没有活性的蛋白质转化成有活性的核糖核酸酶（图2.59）。后来添加的??巯基乙醇促进二硫键重排至天然结构，这一过程大约需要10小时。折叠错误的构型自由能高，转化成稳定的有活性的天然结构时蛋白质自由能低。天然二硫键的交联模式能稳定具有热力学优势的蛋白质结构。
图2.59 重新构建正确的二硫键。在痕量的?-巯基乙醇存在下，二硫键位臵错误的核糖核酸酶能转化成二硫键位臵正确的天然核糖核酸酶。
用其它蛋白质也进行了类似的蛋白质重新折叠试验。在合适条件下，多数蛋白质能重新折叠成天然结构。但是也有些蛋白质变性后重新折叠成天然蛋白质的效率不高。这些蛋白的非折叠状态蛋白易于相互聚集。在细胞内，分子伴侣（Chaperon)能够阻止分子间非法的相互作用。
氨基酸形成??螺旋、??片层、和??拐弯能力不同
蛋白质的氨基酸序列怎样确定蛋白质的三维结构？没有折叠的多肽链如何获得天然结构？要回答这些基本的生物化学问题，首先要确定各种氨基酸形成??螺旋、??片层、和??拐弯能力。一种方案是考察各种氨基酸在??螺旋、??片层、和??拐弯结构中出现的频率（表2.3）。如丙氨酸、谷氨酸、和亮氨酸多在??螺旋，而颉氨酸、异亮氨酸多在??片层。甘氨酸、天冬氨酸和脯氨酸倾向于拐弯结构。