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牦牛儿烯(11.40％)、13一蒎烯(5.85％)、蒈烯一3(3．02％)、古巴烯(5.84％)、石竹烯(8.40％)、奥(4.49％)、D一伪一旺雪松烯(4.53％)、l，3，3一三甲基一[2,2,1.02,6]三环已烷(13.63％)[26]。
1.1.2 天然产物提取工艺与方法
近年来，随着人们对天然产物的药用和营养价值认识的逐步深入，世界范围内掀起了天然产物中活性成分研究的热潮，国家自然科学基金资助项目中就有多项是关于此课题的研究，然而天然产物的成分十分复杂且有些物质含量甚微， 提取时又要求活性成分不能被破坏，溶剂萃取等传统提取方法已远远不能满足对天然产物进行深入研究的需要。如何快速，有效地将活性成分提取出来以及对提取物的进一步分离纯化已成为天然产物研究的瓶颈,特别是近年来人们环保意识的迅速提高和国家可持续发展战略的施行，更使得开发新的天然产物提取技术成为大势所趋。目前，科学工作者在对传统方法进一步改善的同时，又发展出了多种新的提取技术[7]。
对天然产物中活性成分进行提取，最常用的是溶剂萃取法，所用溶剂包括水和有机溶剂，水能够溶出的成分较多，导致后处理困难，有机溶剂分亲水性和亲脂性两种，选择性好，但挥发性大且一般有毒，提取方法主要有浸渍、渗漉、煎煮、回流和连续提取，浸渍和渗漉简单易行。一般在常温或温热条件下操作适于热不稳定成分的提取但溶剂消耗量大、费时长、提取效果差。水煎煮法是我国最早使用的传统方法，大部分成分可被不同程度的煎出但具有挥发性以及遇热易破坏的成分不宜用此法。用易挥发的有机溶剂加热提取则需采用回流法。为了弥补回流提取中溶剂消耗量大，操作麻烦的不足，可采用连续提取，又称索氏提取法。这是溶剂萃取中最常使用的方法，提取效率较高但提取液受热时间长，热不稳定成分易分解[42]。
近来发展的自动索氏提取将高温渗漉与常规索氏提取相结合。溶剂用量比常规索氏提取少一半，且所需时间大幅度缩短。
水蒸气蒸馏也是一种常用的提取方法。被提取的成分应具备以下条件，具有挥发性、沸腾期间与水长时间共存而不发生化学变化、难溶或不溶于水。显而易见上述传统方法具有许多缺点:
1.大量使用有机溶剂产生的废液废渣严重污染环境且不可避免的溶剂残留会影响产物的质量和稳定性。
2.提取效率低，步骤多，选择性差，较难实现自动化或联用提取。
3.温度高，时间长,。使得能耗大且易造成热敏性成分分解和挥发性成分损失。因
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此，发展快速、高效、尽量不用或少用有害试剂、将环境污染减到最低限度的绿色样品处理技术已成为该领域科学工作者追求的目标。
超临界流体萃取法是近二、三十年来迅速发展起来的一项新技术[42]。目前，在我国主要用于天然产物中有效成分的提取。超临界流体是指处于临界温度和临界压力以上的既非气态又非液态的物质，它兼有液体和气体的优点。其密度与液体接近，而密度与溶解能力基本成正比，所以它和液体一样，很容易溶解其它物质。同时，它的粘度和表面张力很小，只是略高于气体。这使得溶质在其中的扩散系数要比在液体中大得多，在临界点附近超临界流体的温度和压力发生微小变化即可导致溶质的溶解度发生几个数量级的变化。根据这一特性9可通过控制体系的温度和压力，使各种待萃取组分按它们在超临界流体中的溶解度大小先后提取出来。并得到初步分离最常用的超临界流体。它的化学性质不活泼、无毒无味、价格适中且具有较低的临界温度和临界压力，是萃取小分子、低极性、亲脂性物质的理想溶剂。但对于糖苷，多萜等极性或大分子化合物则显得无能为力。加入极性改性剂可使CO2的溶解性和选择性得以改善。但如何将超临界流体萃取的应用范围扩大到极性甚至离子型物质仍是该技术今后发展的重要方向之一[42]。
在对紫穗槐果实里化学成分进行提取和分离时，一般采用硅胶柱层析，高速逆流色谱法等方法对紫穗槐种子的乙酸乙酯提取物进行分离，并对提取化合物进行杀菌活性测定。有研究结果是从紫穗槐种子的乙酸乙酯提取物中分离得到7个化合物．分别为5-羟基-7,4-二甲氧基异黄酮、2-羟基-4，4-二甲氧基查耳酮、4一二甲氧基异黄酮、鱼藤酮、2一羟基灰叶素、异灰毛豆酚、异灰叶素。其中鱼藤酮、11一羟基灰叶素、异灰毛豆酚、异灰叶素对黄瓜霜霉活性较好。 发现紫穗槐内大多数黄酮类化合物为抗菌性化合物。
超声波辅助乙醇溶液浸提法和索氏提取法提取新疆地方植物药材紫穗槐中黄酮化合物并进行含量测定。以芦丁为对照品，NaNO2-Al(NO3)3-Na0H体系为显色剂，利用分光光度法在510nm处测定提取物中的总黄酮的含量。校准曲线为A=11．825C-0.0139。r=0.9992。超声提取法所得总黄酮的含量以芦丁计算为2．3562％，索氏提取法所得总黄酮的含量以芦丁计算为2．6375％．平均回收率分别为102．16％和96．53％。索氏提取法的提取优于超声波辅助乙醇浸提法，该法简单、准确，可用于新疆紫穗槐果实总黄酮的测定。
在研究紫罗兰花辩类黄酮化合物的最佳提取工艺时。有方法是采用颜色反应法和紫外一可见光谱法分析紫罗兰白色品种“艾达”(Aida)、红色品种“弗朗西丝克”(Francesco)的花瓣色素，并采用单因素试验和正交试验确定2种颜色紫罗兰花瓣类黄酮化合物的最
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佳提取工艺。 在对紫穗槐进行提取工艺的优化时，就和紫罗兰花瓣的提取有不同之处。先硅胶层析，在通过高速逆流色谱法对层析后的粗组分进行色谱法分离。
1.2 天然活性产物的分析方法
目前国际过内对于从植物等中提取分离的天然活性产物分析方法主要有液质联用法、硅胶层析法、和液相色谱法等，其中液相色谱法又包括固液吸附色谱法、液液分配色谱法、离子交换色谱法、凝胶渗透色谱法、离子色谱法等。 1.2.1 液质联用法
液质联用（HPLC-MS）又叫液相色谱-质谱联用技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在药物分析、食品分析和环境分析等许多领域得到了广泛的应用。
液相色谱－质谱联用仪是以液相色谱为进样分离系统并通过一定的接口与质谱仪耦合到仪器的分析仪器。样品经过色谱分离后经离子源离子化产生带有一定电荷、质量数的离子，采用不同的质量分析器把电离子按质荷比（m/z）分开,得到依质量顺序排列的质谱图。通过对质谱图的分析处理，进行定性、定量分析。液相色谱－质谱联用仪主要由液相色谱、离子源、质量分析器、检测器、真空系统和计算机等几部分组成。
色谱的优势在于分离，为混合物的分离提供了最有效的选择，但其难以得到物质的结构信息，主要依靠与标准物对比来判断未知物，对无紫外吸收化合物的检测还要通过其它途径进行分析。质谱能够提供物质的结构信息，用样量也非常少，但其分析的样品需要进行纯化，具有一定的纯度之后才可以直接进行分析。因此，人们期望将色谱与质谱联接起来使用以弥补这两种仪器各自的缺点。
据统计，已知化合物中约80%的化合物是亲水性强、挥发性低的有机物，热不稳定化合物及生物大分子，这些化合物的分析不适宜用气相色谱分析，只能依靠液相色谱。如果能成功地将液相与质谱联接使用，这一技术将在生物、医药、化工和环境等领域大有应用前景。为达到这一目的需要一个起―接口‖作用的装置将液相与质谱联接起来。
这个接口要解决三个主要的问题：
（1）液相色谱中使用的流速较大，而质谱需要一个高真空环境工作； （2）要从流动相中提供足够的离子供质谱分析；
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（3）去除流动相中杂质对质谱可能造成的污染。
近年来，液相色谱-质谱联用在技术及应用方面取得了很大进展，在环境、医药研究的各领域应用越来越广泛，且随着现代化高新技术的不断发展及液相色谱质谱联用技术自身的优点，液相色谱质谱联用技术必将在未来几年不断发展且发挥越来越重要的作用。
HPLC-MS除了可以分析气相色谱-质谱（GC-MS）所不能分析的强极性、难挥发、热不稳定性的化合物之外，还具有以下几个方面的优点：
①分析范围广，MS几乎可以检测所有的化合物，比较容易地解决了分析热不稳定化合物的难题；
②分离能力强，即使被分析混合物在色谱上没有完全分离开，但通过MS的特征离子质量色谱图也能分别给出它们各自的色谱图来进行定性定量；
③定性分析结果可靠，可以同时给出每一个组分的分子量和丰富的结构信息； ④检测限低，MS具备高灵敏度，通过选择离子检测（SIM）方式，其检测能力还可以提高一个数量级以上；
⑤分析时间快，HPLC-MS使用的液相色谱柱为窄径柱，缩短了分析时间，提高了分离效果；
⑥自动化程度高，HPLC-MS具有高度的自动化。
1.2.2 硅胶层析法
硅胶层析是根据物质在硅胶上的吸附力不同而使物质分离， 一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。硅胶层析主要用于石油产品的精制，脱除芳烃物质或用于中草药有效成分的分离提纯， 硅胶柱层析惯用方法为：
（1）称量。200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量的硅胶H。干硅胶的视密度在0.4左右，所以要称40g硅胶，用烧杯量100ml也可以。 （2）搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。
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（3）装柱。将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约1/3体积石油醚（氯仿），装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚（氯仿）将其冲入柱中。
（4）压实。沉降完成后，加入更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步，可使分离度提高很多，且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。
（5）上样。干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后，加入一些洗脱剂，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。 （6）过柱和收集。柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡，太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。例如：10mg试样量，1g硅胶H，0.5ml馏分；1~2g试样量，50g硅胶（200-300），20-50ml馏分。
(7）检测。要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度一般比喷显剂底1-2个数量级。
（8）送谱。收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体，可过一小凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱1.5ppm左右所谓的―硅胶‖峰。 1.2.3 液相色谱法
液相色谱不能由色谱图直接给出未知物的定性结果，而必须由已知标准作对照定性。
当无纯物质对照时，定性鉴定就很困难，这时需借助质谱、红外和化学法等配合。另外大多数金属盐类和热稳定性差的物质还不能分析，此缺点可高效液相色谱法来克服。
液相色谱法的分离机理是基于混合物中各组分对两相亲和力的差别。根据固定相的不同，液相色谱分为液固色谱、液液色谱和键合相色谱。应用最广的是以硅胶为填料的液固色谱和以微硅胶为基质的键合相色谱。根据固定相的形式，液相色谱法可以分为柱色谱法、纸色谱法及薄层色谱法。按吸附力可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶渗透色谱。近年来，在液相柱色谱系统中加上高压液流系统，使流动相在高压下快速流动，以提高分离效果，因此出现了高效（又称高压）液相色谱法： 液固吸附色谱
(1)高效液相色谱中的一种，是基于物质吸附作用的不同而实现分离。其固定相是一些具有吸附活性的物质如硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。
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